高效液相色谱法检测海水养殖环境中喹诺酮类药物残留.doc

高效液相色谱法检测海水养殖环境中喹诺酮类药物残留 摘要：建立了一种养殖海水中诺氟沙星、环丙沙星争恩诺沙星3种喹诺酮类抗生素残留量的高效液相色谱一荧光测定方法。水样经稀盐酸调PH后经HLB固相萃取柱富集、净化，用外标法定量。结果表明，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星检出限分别是2、1和1 gg／L，定量限分别是6．6、3．3和3．3 ug／L，添加浓度为10、20和50 ug／L时，3种物质的回收率为71．9％～85．3％，批内变异系数≤10％，批问变异系数≤7％。利用该方法对黄海沿岸部分养殖场及近岸海水(北起36。40．303 7 N，1210 8．939’E；南至35。39．36’N，119。52．433’E)进行分析，诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的检出质量浓度分别为6．20～982、55．2和11．6～55．4 ug／L。实验结果表明，该方法灵敏度高，重现性好，适用于养殖海水中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的检测。 关键词 喹诺酮类抗生素 高效液相色谱 固相萃取 海水 喹诺酮类(Quinolones，QNs)抗生素是一族人工合成的新型杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以及毒副作用小的特点，主要用于水生动物弧菌病、链球菌病、水霉病和寄生性疾病的防治，其中诺氟沙星(Norfloxacin，NF)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)和恩诺沙星(Enrofloxacin，EN)等被广泛应用于水产养殖中。目前，我国针对这类抗生素的研究主要集中于水产品中检测技术和代谢动力学的研究(方星星等2004；钱云云等2007；曲晓荣等2007；王洪艳等2007；何平等2008；李娜等2009)。 近年来我国水产养殖业发展迅速，产量和规模不断增加，但由于环境恶化和养殖模式的改变，水生动物疾病频发。为了预防和治疗水生动物疾病，抗生素被广泛应用在水产养殖中。但研究表明，所使用的抗生素仅20％-30％被鱼类吸收，大部分进入环境中(Samuelsen 1989)，而这部分抗生素再次进入食物链，可能导致养殖环境中病菌耐药性的产生，导致二次污染(Hamscher et a1． 2002)。这不仅影响到水产养殖业的健康发展，而且还威胁着生态环境的安全。因此，需要建立水环境中这类药物的检测方法。 高效液相色谱法测定海水中环丙沙星含量的方法，并测定其衰减度，在O～6 h内环丙沙星衰减很快，但6 h后其浓度基本稳定，同时还发现环丙沙星在海水中衰减程度随盐度的增加而加快。利用高效液相色谱法分析城市河水中的多种抗生素，水样由稀盐酸调pH至4．2后经HLB固相萃取，用内标法通过HPLC进行定量分析。对海水养殖环境中喹诺酮类残留量的检测研究报道较少。为减少海水养殖环境中盐分、浮游生物及微小颗粒对喹诺酮类测定存在的干扰，本研究采用固相萃取技术对海水中的3种喹诺酮类抗生素进行富集和净化处理，采用高效液相色谱荧光检测器测定，建立了诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星3种喹诺酮类抗生素残留检测方法，并测试了青岛附近黄海海水养殖区(从36。40．303’N，121。8．939’E至35。39．36 7N，119。52．433 7E)海水中的喹诺酮的含量，为海水中药物的生态风险评估提供依据。 1材料与方法 1．1海水样品 海水样品采自黄海近岸海水养殖区，包括5个采样点(图1)：山东省海阳市大阎家镇某半滑舌鳎养殖场；山东省即墨市鳌山卫镇某大菱鲆养殖场；青岛市太平角海区；青岛市红岛滩涂养殖区；山东省胶南市琅琊镇某海参养殖场。分别用玻璃取样瓶在每个采样点采集500 ml表层海水，4℃密封保存，经0．45um醋酸纤维滤 膜水相滤膜过滤后使用。 1．2仪器和试剂 海能LC7000型高效液相色谱仪，配LC7070荧光检测器；VisiprepTM-DL型固相萃取装置(Supeleo)；漩涡混合器(德国IKA仪器公司)；KQ-600DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli—Q超纯水器(Milli—pore公司)；Laborota400型旋转蒸发器(Heidoplh公司)；PHS-3C精密pH计(雷磁仪器厂)；OasisHLB固相萃取小柱(3 ml／60mg，Waters公司)。 标准品和试剂：诺氟沙星标准品(含量≥99．8％)、环丙沙星标准品(含量≥99．8％)、恩诺沙星标准品(含量≥99．8％)(美国Sigma chemical公司)；甲醇、乙腈为色谱纯；四丁基溴化铵、磷酸为分析纯；实验用水均来自Milli-Q纯水系统。 标准储备液(100 ug／m1)：准确称取诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星标准品各10．0 mg，分别用乙腈溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，于4℃保存(保存期不超过3个月)。 混标使用液：分别取