基因工程课件.pptVIP

A 鸟枪法 真核基因的克隆 真核染色体ＤＮＡ巨大分子量，编码序列只占一小部分，如何分离尤其是单拷贝编码蛋白质基因？ 策略和技术路线： １：人工合成基因ＤＮＡ，特别是数十bpＤＮＡ，直接,有效； ２：构建cDNA文库，筛选cDNA基因； ３：从基因组文库筛选含有目的基因的大片段克隆，两类文库的基因来源不同，路线不同，基因结构不同，目的不同； ４：ＰＣＲ扩增获得特定的目的基因，对于序列已知或部分已知的基因，ＰＣＲ是快速，简便的方法． B cDNA法 真核生物常含有内含子及特定启动子等调控序列,mRNA只占ＲＮＡ的１－３％，在其５‘和３’端分别具有帽子结构等不翻译区域和多聚Ａ片段，所以真核生物与原核生物基因差异很大．要想让真核基因在细菌中表达，不能采用直接来自染色体ＤＮＡ，而只能来自mRNA 的逆转录cDNA．借助于原核细胞的转录和翻译机构可以表达真核cDNA基因．因此合成cDNA及其克隆是基因工程的重要内容 cDNA克隆分为５个步骤： １：单链cDNA合成； ２：双链cDNA合成； ３：与载体ＤＮＡ连接； ４：转化； ５： cDNA基因的分离． 几点注意： １：选用目的基因表达最丰富的组织制备mRNA，大大增加该基因的mRNA浓度； ２：获得全长的，高产率的逆转录产物是最重要的，严格控制反应条件； ３：Ｍg２＋是必需的，酶与mRNA的比例对产率有一定影响； ４：酶的最适pＨ是８