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环糊精与酶的活性位点之间的底物桥接所触发的一种独特的抑制模式 摘要： 背景：甲硫氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素（MetAMC）作为甲硫氨酸氨基肽酶（MetAP）的催化反应的酶作用物，并通常用于筛选化合物以确定潜在的抗生素剂。为了筛选酶的抑制剂，我们观察到用于的溶解疏水性抑制剂——2—羟丙基-β-环糊精 (HP-β-CD)，抑制了酶的催化活性，这种抑制不完全是由于HP-β-CD的底物吸收作用。 方法：通过进行稳态动力学，配体 - 受体结合，X射线晶体学和分子模拟研究方法，对HP-β-CD对MetAP的介质抑制机理进行探讨。 结果：β环糊精酶作用物（β-CD-MetAMC）复合物的X射线晶体学数据表明虽然酶作用物的7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）部分是在环糊精（CD）腔内，但是蛋氨酸部分向外突出。HP-β-CD-MetAMC抑制MetAP的稳态动力学数据符合一个模型机制，该模型机制的底物在HP-β-CD和酶的活性位点口袋之间桥接，形成HP-β-CD-MetAMC-MetAP具有催化性质的无活性三元复合物。分子模型表明HP-β-CD结合MetAMC底物的易断裂键无法到达酶的催化中心的附近，并且因此底物无法裂解。 结论：本文中所呈现的数据表明，这种酶和HP-β-CD的空腔之间的底物桥接是通过其表面的相互作用实现，并且所生成的复合物抑制了酶的活性。 一般意义：由于蛋白质与HP-β-CD通过隔离底物的隐性相互作用，在生理条件下必须谨慎使用HP-β-CD对药物的传送。 关键词：底物桥接 环糊精 甲硫氨酸氨基肽酶 抑制 环糊精–酶作用物复合物 分子模型 文中缩写： MetAP，甲硫氨酸氨基肽酶; MetAMC，甲硫氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素; HP-β-CD，2-羟丙基β环糊精 7-amino-4-methylcoumarin AMC 7-氨基-4-甲基香豆素 β-CD-MetAMC β环糊精酶作用物 1.简介 治疗性控制的需求不断增加，促使识别特定的新型酶目标，以及抑制或调节酶活性的新方法。在过去十年中，甲硫氨酸氨肽酶（MetAPs）已经被认为用于设计抗癌，抗菌和抗肥胖剂的潜在可能物质。甲硫氨酸氨基肽酶是细胞内翻译的过程中除去甲硫氨酸氨基末端而形成的多肽。在约80％的蛋白质中，必须从新合成的多肽中除去普遍存在的带有氨基末端的甲硫氨酸，以便为在生理条件下进行适当的处理，并且不这样做会导致产生非功能性的或不稳定的蛋白质。突变研究表明，产生MetAP的基因对于细菌生存和真核生物的细胞增殖是必不可少的。在各种报告中，MetAPs的抑制剂已被认为是潜在的抗癌，抗疟，抗菌和抗肥胖的药物。与存在于真核生物的酶（类型I和II）不同，细菌包含一个独特类型的酶（I型），便有了找出细菌的MetAP的选择性酶抑制剂作为理想抗生素剂的可能性。 在筛选小分子化合物之时，我们确定了几个结合亲和力达到纳摩尔范围的大肠杆菌METAP的强效抑制剂。然而，由于存在一些溶解性差的化合物，我们无法在体内条件下评估这些抑制剂的功效。为了提高这类抑制剂的溶解度，我们考虑使用环糊精高分子载体。为了实现该实验，我们研究了环糊精在体外对酶催化反应的作用。 环糊精是环状单元，由6，7或8个葡萄糖单元组成，分别称为α，β和γ环糊精，形成外部具有亲水性表面和亲脂性核心的环状分子。他们形成分子量范围大的化合物的包合物，其种类取决于相互作用的客体部分，并且其解离常数范围超过几个数量级。由于其含有非极性腔以及毒性低的特性，环糊精除了在化妆品和药品行业作为新的研究工具之外，还广泛应用作食品中的络合增溶剂。我们知道环糊精可以在生理条件下提高细胞的渗透性（除了溶解度和稳定性）来提高药物的生物利用度。不同的环糊精中，2-羟丙基β环糊精（本文称为的HP-β-CD）已被发现是最有效的药物载体，它已被成功地使用在难溶性药物的制剂。 尝试使用HP-β-CD溶解和稳定一些MetAP抑制剂之时，我们发现上述的大分子载体大大损害了酶的催化活性。这个最初设想是仅由于在HP-β-CD的空腔内的酶的底物（MetAMC）的吸收作用，将消耗可利用水的酶作用物形式，导致酶的抑制作用。当这种简单模型已经与其他酶系统建立联系时，我们发现HP-β-CD使 MetAP发生抑制作用主要是由于HP-β-CD-MetAMC-MetAP复合物的形成，并且该复合物是通过HP-β-CD和酶的活性位点之间的酶底物的桥接而生成。正如结果部分将要详述的，酶作用物的AMC的部分仍限于环糊精的空腔之中，而甲硫氨酸部分在酶的活性位点内相互作用。因为这种组合物质是失活的复合物，所以其整体的酶催化效率受损。以上结论所基于的实验数据将在下面章节讨论。 2材料和方法 2.1材料 2