VERO细胞培养课件.ppt

无血清培养基 由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株 近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖 无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。 目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 常用细胞培养基 1.MEM(minimum essential media) 2.DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium) 3.IMDM（Iscove’s modified Dulbecco’s medium） 4.RPMI-1640 5.199细胞培养基系列 6.欧氏平衡盐 7.F-10,F-12细胞培养基系列 8.水解乳蛋白细胞培养基 9.其它类型细胞培养基 抗生素的使用 在培养液配制后，培养液内常加适量抗生素，以抑制可能存在的细菌的生长 青霉素和链霉素联用 庆大霉素：方便、广谱、稳定 工作浓度 penicillin　 100 units/ml 　　? streptomycin 100 ug/ml　　　　? gentamicin 　　50 ug/ml 　 完全培养基的组成 基础培养基 80％-95％ 血清 5％-20％ 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100u/ml 细胞培养用液的配制与消毒 一、水的制备： 二、PBS的制备与消毒 三、胰蛋白酶溶液的配制 因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制。常用的浓度是0.25％ ,用滤器过滤除菌 四、青、链霉素溶液的配制 1、所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。 2、具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。 3、使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。 RPMI1640培养基的制备 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位／毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌 调节pH值至7.2-7.4 加血清（终浓度 10％） * 设备器材 大型工具类 超净工作台 CO2培养箱 倒置显微镜 液氮罐 酶标仪、微孔板震荡器 消毒灭菌类 紫外灯、压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 配液用具 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 制备细胞用品 耗材：培养瓶，吸管，培养板，冻存管 准备室的设备： 蒸馏器 酸缸 烤箱 高压锅 储品柜（放未消毒物品） 储品柜（放消毒过的物品） 包装台 配液室的设备： 扭力天平和电子天平 PH计 磁力搅拌器 培养室的设备： 液氮罐 低温冰箱（-80℃） CO2孵箱（孵育培养物） 二氧化碳缸瓶 4℃冰箱（放serum和培养用液） 日光灯和紫外灯 储品柜（存放杂物） 水浴锅 边台（书写实验记录） 空气净化器系统 三氧消毒杀菌机 空调 必须放在无菌间的设备： 离心机 超净工作台 倒置显微镜 压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广 电热干燥箱：用干玻璃器皿消毒（160℃，2h） 滤器：过滤法除菌：大多数培养用液(人工合成培养基、血清、酶液等) 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯：用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 超净工作台 工作原理 利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 滤 器 CO2培养箱 设定条件为37℃，5％CO2 使用时应注意： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒 ③箱内灭菌蒸馏水3L蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发 数码型倒置荧光显微镜 CFM-550Z 自动双重纯水蒸馏器 纯水仪 酶标仪 微孔板震荡器 培 养 板 培养瓶 器械的清洗和消毒 实验器材处理 刷洗→包装→消毒灭菌 消毒 和灭菌 干烤 160℃，120分钟 过滤除菌 微孔薄膜过滤 高压 蒸汽灭菌 湿热灭菌 紫外线 消毒 电磁辐射 蒸汽