第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用.ppt

第二十二章 常用分子生物学技术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application 第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology 第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction 三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 第 三 节 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis 基 因 文 库Gene Library 疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes （三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。 第 六 节遗传修饰动物模型的建立及应用 核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用 建立动物模型 ① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型 第一轮筛选 第二轮筛选 第三轮筛选 基因组文库筛选结果举例 第 五 节 克隆疾病相关基因的策略 （一）功能性克隆(functional cloning) （二）定位克隆(positional cloning) （三）非定位候选基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches) （四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches ) 定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。 （一）功能性克隆 应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。 克隆方式 ① 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库； ② 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。 功能互补试验 (functional complementation assay) 利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。 （二）定位克隆 定义 从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。 系统的定位克隆工作 ① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位) 交换分析、连锁不平衡分析 ② 分子生物学分析 染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆 （四）定位候选基因克隆策略 当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。 The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) ——目的基因的受体动物 一、转基因技术 二、核转移技术 目 录 基因剔除技术 也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。 三、基因剔除技术 * 目 录 * 目 录 * 目 录 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理 复性 RNA DNA （一）印迹技术 （二）探针技术 探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分