06 第四次课.ppt

单克隆抗体的制备 动物体内诱导 体外培养法 单克隆抗体的纯化和保存 单克隆抗体纯化 半饱和、饱和硫酸铵 亲和层析 杂交瘤细胞的冻存 DMSO 液氮保存 单克隆抗体的鉴定 单克隆抗体性质鉴定 Ig类型鉴定—双向琼脂扩散 特异性测定 抗体效价检测—ELISA 亲和力鉴定 单克隆抗体与多克隆抗体的比较 单克隆抗体与多克隆抗体的比较 单克隆抗体 多克隆抗体 特异性 均一性 抗体产量 对抗原的要求 抗体的亲合力 沉淀和凝集反应 制备方法 相对的高 相对的低 强 变异性大 不限 不易生产大量均一性的抗体 可以相对的不纯 需要高度纯化的抗原 相对的小 相对的高 一般不能发生 容易发生 复杂、费时、耗工 比较容易 单克隆抗体在放免中的应用 纯化抗原提供新手段 避免交叉反应 促进了放免技术的发展 体内放射显影技术的应用 放射免疫分析 临床免疫教研室 鲍会静 Kris_10713@126.com 放射免疫分析的基本条件 Content 放射免疫分析基本条件 配体的制备与纯化 标准品 特异性抗体的制备与鉴定 标记化合物的制备与鉴定 分离系统 抗血清的制备与鉴定 抗血清的制备 抗血清的鉴定 单克隆抗体的制备与鉴定 单克隆抗体的制备 单克隆抗体的鉴定 单克隆抗体的优点、局限性 单克隆抗体在放免分析中的应用 特异性抗体的制备与鉴定 抗血清制备的条件 免疫原 免疫动物 免疫方法 抗血清的鉴定 抗血清的保存 免疫原的选择 免疫原的分子量 免疫原的纯度 免疫原的用量 免疫动物的选择 原则： 免疫原与动物种属关系 ； 动物个体状况的选择； 抗原性质与动物种类 ； 抗血清用量和要求 ； 常用免疫动物：鼠，兔，驴，马，绵羊 免疫方法的确定 免疫途径 免疫间隔时间 佐剂的选择 佐剂的种类 佐剂的作用 佐剂的乳化 佐剂的种类 成分： 羊毛脂 液体石蜡 BCG 磷脂分子--脂质体 不完全 佐剂 完全 佐剂 佐剂的作用 延缓抗原的释放 刺激巨噬细胞的吞噬能力 增加淋巴细胞在局部淋巴结的通过率 佐剂的乳化 可溶性抗原 福氏佐剂 充分乳化 注射器混合法 抗血清的制备 皮下接种福氏完全佐剂-抗原（l～10mg） 皮下接种福氏不完全佐剂-抗原（l～10mg） ，并重复3-4次，间隔1周 肌肉、腹腔或静脉加强免疫（l～10mg） 2周 1周 抗血清的鉴定 抗体滴度(titer) 结合50%标记抗原时抗血清的稀释度 以反应液中稀释度表示 连续稀释法测定滴度 抗血清的鉴定 抗体亲和力(affinity) 抗原与抗体结合牢固程度 以亲和常数表示 抗血清中抗体分子的浓度 亲和常数的计算 饱和曲线法 抗原浓度 50% B/F K = [AgAb*] / [Ag][Ab*]， 当B / F = 1时， 则 K = 1 / [Ag] [Ag] + [Ab*]===== [Ag-Ab*] 抗血清的鉴定 抗体亲和力(affinity) 以亲和常数表示 抗血清中抗体分子的浓度 亲和常数的计算 饱和曲线法 Scatchard作图法 抗血清的鉴定 抗体亲和力(affinity) 以亲和常数表示 抗血清中抗体分子的浓度 亲和常数的计算 饱和曲线法 Scatchard作图法 Adrion计算法 K = 8/3 [ I50－T ] I50 = 标准 B / B0 % 为50%时的抗原浓度 T = 标记抗原的量 抗血清的鉴定 抗体特异性(affinity) 以交叉反应率表示 交叉反应率 = [待测抗原50%结合时的浓度] / [待鉴定类似 物50%结合时的浓度]?100% 提高抗体特异性方法 特异性分子片段免疫动物 进一步纯化 单克隆抗体代替抗血清 单克隆抗体的制备 细胞融合技术发展 骨髓瘤细胞株的建立 1975 Koehler and Milstein Nature ”分泌预定特异性抗体的融合细胞持续培养“ 1984 诺贝尔医学与生理学奖 单克隆抗体制备的基本原理 杂交瘤技术 小鼠骨髓瘤细胞 细胞株稳定、易于传代培养 细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子 该细胞是HGPRT的缺陷株 目前常用的为NS-1和SP2 /O细胞株 单克隆抗体制备的基本原理 杂交瘤技术 免疫脾细胞 BALB/c小鼠 8~12周 体重约20g 雌雄均可 免疫用抗原提高纯度和活性 免疫途径多为腹腔和皮内多点注射法 如果抗原珍贵，可采用脾脏内直接注