作程序基因工程的基本操.docVIP

第2节 基因工程的基本操作程序 【本节重难点】 重点：基因工程基本操作程序的四个步骤 难点：（1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 【知识精讲】 教材梳理 基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 知识点一 目的基因的获取 1.获取目的基因是实施基因工程的第一步。目的基因的获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来 ②用人工的方法合成。 2.基因文库——将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，成为基因文库。 基因文库根据其大小可分为基因组文库和部分基因文库。 受体细胞是指接受目的基因的细胞，即表达载体导入的细胞。 基因工程常用的受体有细菌、真菌、动植物细胞（1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 （2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 （3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 （4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 （5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。 从基因文库中找到所需要的基因从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。 第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，与扩增出来的DNA杂交。 第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。 第三步，按Southern杂交的方法进行杂交。 第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。 第五步，从该菌落中再提取目的基因。PCR的扩增过程PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程。 第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95 ℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。 第二步：将反应体系降温至55～60 ℃，使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。 第三步：将反应体系升温至70～75 ℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。 上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。A.解旋酶 B.DNA连接酶 C.限制性内切酶 D.RNA聚合酶 分析：本题考查的知识点是DNA分子杂交原理选项BD可以直接排除对于选A可能理解的：既然是检测突变的部位,那么很自然想到用该基因的探针，进行碱基互补配对杂交而检测之(相关知识教材鉴定人猿亲缘关系和基因工程处都有所涉及)，但是分子杂交的前提必须是单链DNA，于是很自然想到用解旋酶处理被检测基因。但是，解开DNA双链结构一定要用解旋酶，在高温或者用强碱溶液处理也可以得到单链DNA，而且题干上也有必须使用的酶的叙述，所以可以排除A选项。C选项限制酶只是把原DNA切成很多片段，其中某个片段可能包含突变的目的基因，然后再用化学方法处理成单，最后再和探针杂交，根据放射性(或荧光)出现部位而检测出突变部位这种技术其实就是所谓的基因诊断他方法把DNA处理成单链但是，已经变性成单链的DNA很有可能常温下复性，可能回折重新形成许多双链区，如果恰恰突变部位及其临近区域和该单链其他区域结合成双链，那么必然影响探针与相应部位的结合，也就无法准确检测到突变部位。