石蜡包埋切片技术.docVIP

石蜡包埋切片技术 实验目的： 1、学习石蜡包埋切片技术的基本原理和基本步骤； 2、掌握石蜡包埋切片技术。 实验原理： 大家在生物学实验时，曾经观察过动物组织和植物组织的切片。通过光学显微镜，我们可以观察到细胞内部的结构（例如细胞核、细胞质、肌肉组织的横纹等）、细胞相互间的联系以及组织的构成等。那么，如何来制作这种切片呢？其过程是比较复杂的，我们利用3—4次实验来学习组织切片的制作。 大家知道，我们要在显微镜下研究生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察的，因为整个动、植物体大部分都是不透明的，不能直接在显微镜下观察，一定要经过特殊的处理，使要观察的材料先减少它的厚度和体积，使光线能透过才能用显微镜观察。通常应用的有两种方法：一种是非切片法，即用物理或化学的方法将生物体组织分离成为单个细胞或薄片，例如我们在生物学实验曾做过口腔上皮的观察、洋葱鳞茎表皮的观察。这种方法的不足之处在于细胞彼此间相互的联系不一定观察到。另外一种为切片法，即用刀将标本切成薄片。 非切片法比较简单，一学就会，我们这里不作介绍。 切片法也分徒手切片法和切片机切片法。最简单的切片法是将新鲜植物材料直接用刀切成薄片，称之为徒手切片法。切片机切片法是用特殊的切片机来切片，切片的厚度可薄到几个微米。因此，切片机的发明与应用也是细胞学诞生的重要因素。 切片机切组织用的也是刀（切片刀），所要切的组织要有一定的软硬度，如刀切肉（新鲜、冷冻）。但大部分生物材料比较柔软，所以为了能切出薄片，必须先使所切材料有一定的软硬度。一些包埋剂可以达到这个目的，如石蜡，它融化时可渗入到组织内部；凝固时，使整个组织有一定的软硬度，正好能切出很薄的切片，故称为石蜡包埋切片法。另外还有火棉胶包埋切片法（火棉胶做包埋剂）、冰冻切片法（使组织冷冻到一定的硬度）等。其中最常用的切片方法还是石蜡包埋切片法，我们这里重点学习石蜡包埋切片技术。 实验器材： （一）小鼠、小广口瓶、标签、量筒、烧杯、95%酒精、无水酒精、蒸馏水、手术刀、剪刀、镊子、平皿、石蜡块、滤纸、甲醛液、苦味酸、冰醋酸、移液管、洗耳球。 （二）恒温箱、融蜡、纸盒、烫板、支架、酒精灯、火柴、小镊子、滤纸。（擦载玻片、磨刀、液体石蜡）。 （三）手术刀、木板、酒精灯、火柴、锯条、木块、塑料板、切片刀、切片机、毛笔、小镊子、载玻片、蛋白甘油、恒温水浴箱、温度计、大白盘。 实验步骤： 制作小鼠肝、脾、肾、小肠等切片。 1、取材：取材是指从动物或植物体上割取所要观察的组织材料，比如植物的茎、叶，动物的肝脏、小肠等。 取材时应注意以下几点： （1）新鲜：在割取材料时应愈快愈好，否则动植物体的细胞成分、结构及分布等就会发生改变。 （2）防止人为损伤：如生拉硬拽、挤压等，以免出现人为损伤。 （3）大小：0.5 cm × 0.5 cm × 0.2cm。 2、固定：机体死亡或组织离体后，组织细胞由于血液供应停止，即可发生缺氧，导致生物氧化过程停止。相反，细胞内的无氧酵解酶类活跃，使组织内蛋白质、糖、脂肪降解，导致组织发生自溶。另外，组织也可因污染细菌而发生腐败。因此，为了使细胞和组织结构保持生活时的状态，必须进行适当的固定。固定的目的在于保存组织内细胞的形态、结构及其组成，使其与生活时相似。 固定组织的物质——固定剂——具有凝固或沉淀组织蛋白的作用，因此能抑制酵解酶类的活动和细菌的繁殖，从而呈现对组织的固定作用。 固定剂的种类很多，最常见的有乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞和锇酸等8种。各种固定剂对蛋白质、脂肪、糖等作用不同，因此，单一的固定剂不能保存所有的成分，故多用混合固定剂。 各种书籍对固定剂的介绍特别多，如化学性质、固定的原理、固定组织的优缺点等，由于时间的所限，我们这里不作详细介绍，仅介绍几种常见的固定液及其配方和用途。 （1）10%福尔马林液：1份甲醛液 + 9份蒸馏水 市场上出售的甲醛液约含37-40%的甲醛，10%福尔马林液实际上仅含3.7-4.0%的甲醛。 适用范围：各种组织。但是经10%福尔马林液固定的组织，细胞核染色较好，而细胞质染色较差。 处理：组织块一般固定16-24h，长时间亦可，甚至可用来长期保存组织块。短时间固定的组织块不需水洗，可直接转入70%酒精脱水。 （2）Bouin氏液：苦味酸饱和水溶液（1.22%）???? 75ml （15） 甲醛液??????????????????????? 25ml （5） 冰醋酸??????????????????????? 5ml? （1） 适用范围：各种动物组织及植物组织的根尖，是动物组织良好的固定液。 处理：固定24h，也可在此液长期保存。流水冲洗或不经水洗直接入70%酒精脱水。 （3）Zenker氏液：?? 甲液：氯化汞（升汞）?? 5g 重