利用聚乙二醇为媒介物进行细胞融合.docxVIP

实验报告课程名称：细胞生物学指导老师：成绩：实验名称：利用聚乙二醇为媒介物进行细胞融合实验类型：细胞结构观察 同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）三、主要仪器设备（必填）五、实验数据记录和处理七、讨论、心得二、实验内容和原理（必填）四、操作方法和实验步骤六、实验结果与分析（必填）一、实验目的和要求⒈掌握小鼠脾脏细胞的提取方法。⒉学习细胞融合技术，观察不同处理条件获得的融合细胞的形态及变化，计算融合率 。二、实验内容和原理细胞融合是两个或以上保持完整的细胞在特殊条件的作用下，相互接触进而发生膜融合，最终使细胞融合成双核或多核细胞的现象。细胞融合得以发生，是基于细胞质膜的流动性以及至双分子层自组装的特点。 细胞融合是细胞工程试验技术之一，对于动、植物细胞均取得了重要的研究和应用成果。例如，能够产生抗体的淋巴细胞与肿瘤细胞间的细胞融合是制备单克隆抗体的基础。早熟染色体凝集的研究与有丝分裂促进因子的发现也是基于细胞融合技术。植物细胞原生质体融合是植物细胞工程的一种技术手段，在植物育种等方面有着较为广泛的应用。 实现细胞融合的方法主要有化学诱导融合、电刺激诱导融合以及灭活病毒诱导融合，本实验采用化学诱导融合，用 PEG 处理小鼠脾脏细胞。 在使用 PEG 溶液处理提取的小鼠脾脏细胞后，再以 GKN 液清洗，细胞的融合效果较好。PEG 是一种高分子化合物，相对分子质量在 200~6000 之间的均可用作细胞融合剂，常用质量浓度是 200~500g/L。PEG 能诱导细胞融合的机制是由于 PEG 能够吸收大量水分，当两个相邻的细胞间的水分被 PEG 大量吸收时，细胞质膜磷脂分子的排列发生改变；为了使细胞处于较为稳定的状态，相邻的细胞由于接口处双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通。这种方法稳定性好，但对细胞有一定的毒性。 电刺激融合的基本原理为：在瞬时的强电场的作用下，细胞膜发生可逆性的电击穿，可诱导相互接触的细胞膜的融合，从而发生细胞融合。这种方法无化学毒性，对细胞损伤小。 灭活病毒诱导细胞融合的原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，是细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 在本实验中，细胞融合的效率可以用融合率来衡量。取一视野，融合率=发生融合的细胞数/视野中的所有细胞数。其中，判断细胞是否融合的依据是两个细胞核是否有部分重合。影响效率的因素包括细胞密度、融合剂的浓度和处理时间。为研究这些因素对实验的影响，可以设置多组对照（时间梯度、浓度梯度对照，空白对照） 。三、主要仪器设备⒈材料小白鼠⒉器材冷冻离心机、解剖盘、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、滴管、小烧杯、显微镜、离心管、移液枪。⒊试剂生理盐水、固定液（甲醇-冰醋酸3:1）、75mmol/L KCl溶液、GKN 液、PEG 溶液、90%乙醇、吉姆萨染液。四、操作方法和实验步骤⒈取脾脏小鼠断颈处死，酒精棉球消毒后在方盘上解剖，打开腹腔，取出脾，去除多余脂肪组织，放入培养皿中，37 ℃GKN液清洗3次。每次5mL。 ⒉取脾脏细胞、计数用1毫升注射器向脾内注射0.2mL，置于含有5毫升GKN液的培养皿中，将注射器针头折弯成L型，将脾细胞轻轻挤出，吹打使细胞散开。不锈钢网过滤细胞悬液，加入5mLGKN液1500r/min离心10min，弃上清液。5mlGNK重悬，细胞计数。⒊融合40℃水浴预热1-2min。在预热的离心管中迅速加入不同浓度的PEG溶液。这里要求一滴一滴加入，但加入时间不超过30秒，边加边摇动离心管，加完后室内静置10分钟。1500r/min离心10分钟，弃上清液。⒋制细胞悬液加入少量GKN液，吹打使细胞散开⒌制片涂片, 烘干或电吹风吹干 ⒍固定少量90%乙醇滴于玻片上固定90s⒎染色添加Gimsa工作液于玻片上染色20min。弃染液，水冲洗（注意：水冲洗时候不要直接冲洗有细胞面，可以冲洗玻片反面） ⒏镜检在低倍镜下找到融合的细胞，进行融合细胞的计数，计算融合率。实验名称：_ __________________姓名：学号：五、实验结果图一.细胞计数76　　　94　　　69　　　95　　　102细胞计数结果五个区域取平均后计算细胞悬液的细胞密度（76+94+69+95+102）÷5×25÷10-4 =2.18×107（个）/cm3 后面的实验因为固定没有成功，未能观察到染色成功的细胞，故后续实验采用同班其他小组的实验数据和图：（图2-图6）实验名称：_ __________________姓名：学号：下文比例均为染色细胞液：PEG1:14 1:1图2. 1:14细胞融合染色图 图3. 1:1细胞融合染色图融合效率：