11.1-沉淀反应辩析.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第十一章 沉淀反应 第一节 沉淀反应的特点 第二节　液体内沉淀试验 第三节　凝胶内沉淀试验 第四节 免疫电泳技术 1.沉淀反应（precipitation）: 是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象,其特性与经典的抗原抗体反应相同。 第一节 沉淀反应原理及特点 2.沉淀反应分两个阶段 第一阶段： 抗原抗体特异性结合，快速但不可见。 第二阶段： 形成肉眼可见的大的免疫复合物。 免疫浊度测定 絮状沉淀试验 单向扩散试验 双向扩散试验 对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫电泳 免疫固定电泳 ①液体内沉淀试验 ②凝胶内沉淀试验 ③凝胶免疫电泳技术 3.沉淀反应的类型 絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。 方法受抗原抗体比例的影响非常明显 应用于测定抗原抗体反应的最适比例 三种类型： ① 抗原稀释法：抗原最适比例 ② 抗体稀释法：抗体最适比例 ③ 方阵滴定法：抗原抗体最适比例 一、 絮状沉淀试验 第二节　液体内沉淀试验 抗体 稀释度 抗原稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照 1/5 + + + + + + + + + + + + ± — 1/10 + + + + + + + + + + + + + — 1/20 + + + + + + + + + + + + + — 1/40 — ± + + + + + + + + + — 1/80 — — — — + + + — 最适比例方阵测定法 二、免疫浊度测定 1.原理 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。 2.影响因素 ①抗原抗体的比例： 反应体系中保持抗体过量 ②抗体的质量: 特异性强，效价高，亲和力强。 ③抗原抗体反应液的最适PH: 为6.5～8.5 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。 第三节　凝胶内沉淀试验 一、原理 二、方法 1、单向扩散试验 （平板法） ?原理： 抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。可以定量。 ?技术要点： 将抗体混入0.9%琼脂糖内（50℃），未凝固前倾注成平板，凝固后打孔（直径3～5mm ），孔中加入抗原溶液和不同浓度的标准品，置湿盒内37℃,24～48h 观察孔周围是否出现沉淀环。 倾注平板　打孔　加样　 放置37℃　24～48h观察沉淀环 单向扩散试验（平板法） ?影响因素： －抗体质量 －标准曲线 ，质控血清 －结果与真实含量不符 －双环现象（不同扩散率抗原性相同的两个组分） 上排为5个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右2为异常病理血清 2、双向扩散试验 （平板法） ?原理： 将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一 ?技术要点： 平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在3～5 mm之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周围是否出现沉淀环。 ? 应用 a.抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计； b.抗原或抗体相对分子量的估计; c.抗原性质的分析; d.抗体效价的滴定; e.抗原或抗体纯度的鉴定。 优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 　　3.增加了分辨率。 　　　 抗原抗体反应 的高度特异性 电泳技术的高 分辨率、快速、 微量 第四节　免疫电泳技术 电泳分析 ＋ 沉淀反应 原理：双向扩散 + 电泳 比双向扩散试验灵敏度提高8～16倍 技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳。 一、对流免疫电泳 － 蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动 抗体球蛋白 带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动 ＋ 对流免疫电泳 通电 结果分析： 无沉淀线出现则表明无相应的抗原。 沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。 沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗