3.质粒DNA的限制性酶切鉴定-2012终稿.pptVIP

EcoRI BamHI 实验三 重组质粒DNA的限制性酶切鉴定 【一、实验目的】 学习通过限制性酶切法鉴定阳性克隆的方法原理与技术。 【二、实验原理】 限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。 内切酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。 37℃ 【四、实验步骤】 1、在一个洁净的0.5 ml离心管中混匀下列反应物： 反应物 体积（μl） 灭菌水 11 10×Buffer 2 质粒DNA 5 EcoR I,BamH1 1 总计 20 2、将反应物置于37℃水浴,2h。 3、琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。 【三、实验仪器、材料与试剂】 （一）实验仪器 微量移液器 微型离心机 恒温水浴锅 （二）材料和试剂 重组质粒pGADT7-X(7988+300bp),pGBKT7-X（7300+300bp） EcoRI,BamHI及其酶切缓冲液 H2O 思考题 如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全, 你认为可能是什么原因？ (1)分子克隆：载体 多克隆位点 （2）提取重组质粒，如何鉴定，三种方法 （1）如果用同一种酶切割载体和插入DNA两者能正确连接，但不能确定方向。 如果用不同的限制酶切割，所得的单链突起能互补，则两者能正确连接。但也不能确定其方向。 若限制酶切割所得的片段是平末端，虽能连接，但效率低，而且不能确定其方向。 用两种不同的限制酶共同切割载体或插入，而且所得两末端结构不同，连接后就能确定其方向。 因此，运用两种不同的限制酶的模式被广泛应用。 （2）在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分别是NdeΙ和NotΙ，这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端，可以保证酶切产物与载体正确的连接。 (1)分子克隆：载体 多克隆位点 （2）提取重组质粒，如何鉴定，三种方法 （1）如果用同一种酶切割载体和插入DNA两者能正确连接，但不能确定方向。 如果用不同的限制酶切割，所得的单链突起能互补，则两者能正确连接。但也不能确定其方向。 若限制酶切割所得的片段是平末端，虽能连接，但效率低，而且不能确定其方向。 用两种不同的限制酶共同切割载体或插入，而且所得两末端结构不同，连接后就能确定其方向。 因此，运用两种不同的限制酶的模式被广泛应用。 （2）在我们今天的实验中，用到两种限制性酶分别是NdeΙ和NotΙ，这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端，可以保证酶切产物与载体正确的连接。