3第三章 菌种保藏赤峰工业职业技术学院.ppt

菌种保藏 菌种的保藏 菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。 一、菌种保藏的目的 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、 二、菌种保藏的原理 首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。 其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。 尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株 三、菌种保藏方法 各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。 斜面低温保藏法 甘油冷冻管保藏法 试管熔封（密封）保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 （一）斜面低温保藏法－常用保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续。 此法适用于细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏短期保藏. 此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6个月左右。 优点：简便易行、容易推广，适用于大多数微生物 缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短；传代次数多；菌种容易发生变异和被污染。 大肠杆菌斜面 金黄色葡萄球菌斜面 生孢梭菌 白色念珠菌需气菌、厌气菌培养基 真菌培养基 （二）甘油冷冻管保藏法 将待保藏菌种接种在适宜的斜面培养基上，适宜温度下培养适宜时间后，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中，调正菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管，向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装无菌小管，最好在-30℃条件下储存，一般可保存2年. （三）试管熔封（密封）保藏法 熔封 用各种琼脂斜面（普通肉汤等）常规灭菌后，经接种，室温培养24～48h后，将接种菌生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封，分别置室温和冰箱下保存。使用时，用砂轮在管口划一圈，在乙醇灯下火烟灭菌后敲开管口即可转接到另一斜面上。室温保存期可达3年，特别是适宜一些因培养物陈旧极易死亡的铜绿假单菌。 密封 将需保存种菌按无菌操作要求接种至固体培养基塞紧棉塞，放在干燥器内，干燥器密封处涂上凡士林，盖紧后使之与真空泵相连接。开动真空泵抽真空30min至1h（真空度约为640）关闭密封口， 拨出胶塞，置于室温下保存。待用时，打开盖，取出种菌，接种至培养基上即可。 （四）石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加硅胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。 此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存1～2年左右。 （五）冷冻真空干燥保藏法 又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。 此法适用于各大类微生物。 此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂， 保藏期一般长达5～15年，存活率高，变异率低，是目前 被广泛采用的一种较理想的保藏方法。 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设 备。 （六）液氮超低温保藏法 简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（－196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。 此法适用于各种微生物菌种的保藏。 此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。 此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。 菌种的保藏条件及时间 菌种 培养基 保存条件及时间 大肠埃希菌 营养琼脂培养基 4℃~ 6 ℃保存2 ~3个月 金黄色葡萄球菌 营养琼脂培养基 4℃~ 6 ℃