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第九章 核 酶 工 程 1981年Cech等发现四膜虫的核糖体前体RNA可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除内含子，完成加工过程。 该具有催化活性的RNA的发现改变了传统上“酶是蛋白质” 的观念，从此对具有催化活性的RNA，即核酶(ribozyme)的结构、催化机制以及应用的研究日益深入。 核酸分子在总体的催化潜力上和蛋白质相差甚远，但由于可以遗传和变异而被自然界保留下来催化一些特殊的反应。  核酶由于具有许多优点而受到重视，例如用于治疗的核酶注射入体内不会产生免疫原性，对具有切割活力的核酶可以更加自由的设计其切割RNA的位点。 分子进化工程的诞生，使核酶的研究迅速发展，人工进化出自然界中不存在的多种功能的核酶（包括单链DNA酶），这些研究成果在理论和实际应用中都有着巨大的意义。 一、天然核酶 目前为止，在自然界中发现的核酶根据其催化的反应可以分成两大类： 剪切型核酶  核酸酶 剪接型核酶 1、剪切型核酶——催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶。——主要包括锤头型核酶，发夹型核酶，丁型肝炎病毒(HDV)核酶，以及有蛋白质参与协助完成催化的RNaseP 2、剪接型核酶——实现mRNA前体自我拼接，具有核酸内切酶和连接酶两种活性。——主要包括组I内含子和组II内含子 一 锤头型核酶 R. Symons等在比较了一些植物类病毒、抗病毒和卫星病毒RNA自身剪切规律后提出锤头结构（hammerhead structure）状二级结构模型。 它是由13个保守核苷酸残基和三个螺旋结构域构成的。——（后来Koizumi等证明只需要11个特定保守核苷酸）。 Symons等认为，只要具备锤头状二级结构和13个保守核苷酸，剪切反应就会在锤头结构的右上方GUX序列的3’端自动发生。无论是天然的还是人工合成的锤头结构都由两部分构成：催化结构域（R）和底物结合结构域（S）。 William B. Lott等提出了锤头型核酶催化反应的两种可能的化学机制：——“单金属氢氧化物离子模型” ——“双金属离子模型”)。 二 发夹型核酶 发夹型核酶的二级结构模型 三 蛋白质-RNA复合酶(RNaseP) 蛋白质-RNA复合酶主要催化tRNA前体成熟过程。——例如S. Altman和N. Pace两个研究组合作发现的大肠杆菌tRNA5’成熟酶。 　　蛋白质-RNA复合酶酶由蛋白质和M1RNA两个组分构成．——蛋白质的分子量为20kDa，——M1RNA含有377个核苷酸。　　M1RNA单独具有全酶活性，　　蛋白质只是维护M1RNA的构　　象。 　　实验证明来自不同原核细胞RNaseP中的M1RNA具有相似的三维结构。——与前面几种剪切型核酶不同的是，RNaseP催化得到的产物的3’端是羟基，5’端是磷酸。 四 　组I内含子和组II内含子 组I内含子(group I intron)和组II内含子(group II intron)——这类核酶比较复杂，通常包括200个以上核苷酸，主要催化mRNA前体的拼接反应。 　　像蛋白质酶一样，内含子形成高级结构的折叠结果使关键残基形成活性部位，在辅助因子的参与下实现自身剪接。 　　组I内含子能够自身剪接的是与它们保守的二级和三级结构有关。 　　除了剪接之外，组Ⅰ内含子还可催化各种分子间反应，包括剪切RNA和DNA、RNA聚合、核苷酰转移、模板RNA连接、氨酰基酯解等。 　　在体外，组Ⅱ内含子的剪接是经过两个转酯化反应来实现的，无蛋白质参与。 　　组Ⅰ和组Ⅱ内含子的主要差别是第一步反应的化学机制。 　　在组Ⅰ内含子中，外部的鸟苷的3’-羟基作为进攻基团，而在组Ⅱ内含子中是内部腺苷的2’-羟基起作用(图 7-4b)。 这个反应的结果形成一个带突环的内含子-3’外显子分子，其中第一个核苷酸经由2’，5’-磷酸二酯键与内含子的A相连。在第二步反应中，5’外显子的3’-羟基进攻内含子-3’外显子连接点，结果是两个外显子相连，并释放出带有突环的内含子。 核酶(脱氧核酶)的应用 基因治疗的概念出现在二十几年前，现在已经在临床上得到了实际应用。基因治疗最早的临床研究是1990年Blaese 等进行的对腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的治疗，随后在对遗传病、病毒侵染、肿瘤等疾病的治疗中得到广泛的应用。中国也是开展基因治疗比较早的国家，1991年薛京伦等开展了血友病B基因治疗的临床实验，并取得比较理想的效果。 基因治疗的主要策略可以分为: (1) 向体内导入外源基因取代体内