免疫组织化学技术.ppt.ppt

免 疫 组 织 化 学 技 术 陈 芸 第一节 免疫组织化学技术 免疫组织化学（Immunohistochemistry）或免疫细胞化学（Immunocytochemistry）是利用抗原抗体特异性结合的原理，主要用标记抗体追踪定位抗原，以确定组织和细胞中的某种化学物质。 免疫组织化学的基本原理，是用标记物或 显色物标记的抗体检测组织或细胞内的抗 原，用于疾病的诊断或研究。 新鲜组织的冻存 新鲜组织离体后应及时冻存，如需送至其他实验室冻存可先置于4℃生理盐水中，但时间不宜超2～6过小时。制备冻块的原则是低温及速冻。速冻的目的是使抗原迅速固定和防止冰晶形成，冰晶形成将破坏细胞结构。低温速冻的方法有：丙酮–干冰法、液氮法。 石蜡包埋的组织固定及脱水包埋 用于石蜡包埋的组织及时取材后应立即置于适当的固定液中，组织块不宜过大，以免固定剂及其以后处理过程中液体不宜穿透组织，一般为1×1×0.3cm大小。 固 定 对固定液的要求是：①能保存抗原的完整性，防止抗原的弥散；②不影响抗原–抗体反应；③保留良好的组织形态和结构；④检测不同的抗原要求不同的固定液，应根据定位的抗原分子大小，结构和性质而选择合适的固定液。 10%中性缓冲福尔马林液 40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的 PBS90ml 影响固定的因素 固定时间 固定时间过短将影响抗原的固定和细胞形态，过长能引起抗原遮盖或抗原变性，因而要选择一合适的固定时间。 固定温度 一般固定剂的固定作用随温度升高而加强，固定的温度以室温最为常用。 固定的注意事项 组织标本慎防干涸，应尽快地放入固定液固定；组织块不大于2cm2，厚0.5cm；固定液量一般不少于200毫升；固定后组织标本应彻底冲洗以去除过量的固定液。 组织的脱水、透明、浸蜡和包埋 组织切片 载玻片的处理 ﹙1﹚载玻片的清洁 新载玻片常附有油质，故必须经清洁液浸泡，流水 漂洗后用蒸馏水清洗，然后浸泡于95﹪酒精内，再用绸布擦干备用。 ﹙2﹚黏附剂 为了确保染色过程不脱片，清洁后的载玻片宜涂黏附剂。涂黏附剂后玻片可置65℃恒温箱内干燥过夜后备用。 冰冻切片 石蜡切片 免疫组织化学染色 内源性酶和内源性生物素的阻断 内源性过氧化物酶主要见于红细胞的血红蛋白，中性粒细胞内的髓过氧化物酶及单核细胞，嗜酸性细胞和组织内的过氧化物酶。 阻断剂：3% H2O2–甲醇液，10～15分 钟 内源性碱性磷酸酶 内源性碱性磷酸酶主要见于中性粒细胞和内皮细胞。 阻断方法是应用1M左旋咪唑。 内源性生物素 有些脏器（如肝、胰腺及肾）的细胞含有多量的生物素或类生物素物质，它们能与卵白素反应。 非特异性背景染色 第一抗体前加与制备第一抗体相同动物的非免疫血清，封闭组织上带电荷集团而除去与第一抗体非特异性结合 增强特异性染色的方法 蛋白酶消化法 其作用是暴露抗原，增加组织和细胞的通透性，以便抗原与抗体最大限度的结合，增强特异性染色和避免非特异性染色。常用的有胰蛋白酶、胃蛋白酶、琏蛋白酶等 合适的抗体稀释度 抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓度过高，抗体分子多过于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴性结果。此阴性结果并不一定是缺少抗原，而是由于抗体过量，这种现象类似于凝集反应中的前带效应（prozone effect） 抗体稀释度应根据：①抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；②一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长；③对于抗体中非特异性蛋白的，只有高稀释度时才能防止其非特异性背景染色；④稀释用缓冲液的种类，标本的固定和处理过程等也可以影响稀释度，所以合适的稀释度应根据具体情况测定。 温育时间 大部分抗体温育时间为30～60min，必要时可4℃过夜（约18h）。温育的温度常用37℃，也可在室温中进行，对抗原抗体反应强的以室温为佳 热诱导的抗原修复 抗原修复（antigen retrieval；AR）是以高温高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复处理，可以提高抗原抗体阳性检测率，同时也会出现假阳性 。现已广泛应用于免疫组织化学各领域的研究。 热诱导的抗原修复应注意的问题： 热处理后应注意自然冷却。 热处理液不要让其煮干。 不要任何抗原的检测都使用该方法。 一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。 形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。而经酶水解