第十一章 蛋白质的相互作用（Protein-Protein Interactions）.docVIP

第十一章 蛋白质的相互作用(Protein-Protein Interactions) 1. 概况 随着人类基因组测序工作的完成，生命科学进入到后基因组和蛋白组的时代。因此，蛋白质的相互作用研究就显得越来越重要。生命活动过程与蛋白质的相互作用是密不可分的，如DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、细胞周期调控、信号转导等重要的生命过程均涉及到蛋白质复合体的作用。下面以Wnt信号通路为例对此加以说明。 Wnt信号通路是一条保守性很强的信号通路，该通路调节控制许多的生命过程，如细胞形态与功能的分化及维持、免疫、应激、细胞癌变与凋亡等等。Wnt信号通路的作用分子包括：Wnt蛋白家族成员、卷曲 (frizzled) 蛋白、Dishevelled蛋白、β-联蛋白(β-catenin)、轴蛋白(axin)、结肠癌抑制因子(APC)、糖原合酶激酶(GSK3β)、β-TrCP蛋白、淋巴增强因子 (LEF)/T细胞因子 (TCF) 等。当没有Wnt信号时，GSK3β、APC、axin组成破坏复合体，使β-联蛋白被磷酸化，最终泛肽化而降解。细胞核内，转录抑制因子Groucho家族成员与转录因子TCF形成复合物，通过HMG框结合在靶基因上，抑制靶基因的转录。当有Wnt信号传入时，通路中的下游分子Dsh抑制了破坏复合体的作用，β-联蛋白在胞质中积累进入核内，TCF与入核的β-联蛋白结合，导致其与Groucho的结合下降，从而去除抑制作用，激活了靶基因的转录。 从上面可以看出，蛋白质的相互作用包括三个方面： ⑴ 多亚基蛋白质的形成：即分离纯化后可形成两个或多个不同蛋白质，如血红素、色氨酸合成酶、大肠杆菌DNA合成复合酶等。 ⑵ 多成分的蛋白质相互作用，如核孔复合体、剪接体、纺锤体等。 ⑶ 瞬时的蛋白质相互作用，控制着一些重要的生命活动。所有的蛋白质修饰过程都需要这类相互作用。这类相互作用几乎参与调节细胞内基本生命活动的所有形式，如细胞生长、细胞周期、代谢途径、信号转导等。 除了蛋白质修饰以外，其他过程如转录复合体与特定启动子的结合、蛋白质的跨膜运输、新生肽链的折叠、也包含了瞬时的蛋白质相互作用。 2蛋白质相互作用的研究策略与方法 2.1生化方法 2.1.1蛋白质亲和层析 ⑴ 方法 在一定的条件下，某种蛋白质可以共价连接在基质如琼脂糖 (Sepharose) 上，用以结合抽提物中能与该种蛋白质结合的配体蛋白质，抽提物过柱后，用低盐溶液洗脱下未结合的物质，然后用高盐溶液或SDS洗脱下结合在柱上的蛋白质。有时污染物的存在会影响相互作用的结果，因此蛋白质纯化是蛋白质亲和层析成功的前提。 ⑵ 蛋白质的纯化方法 获得纯化蛋白质的一个简单方法就是利用融合蛋白，目前常用的融合蛋白为谷胱甘肽S转移酶 (glutathione S-transferase, GST)，可以在谷胱甘肽-琼脂糖柱上纯化。其他的还有staphylococcus蛋白A可在含IgG的柱上纯化；含少数组氨酸的肽段在镍柱上纯化；麦芽糖结合蛋白可以在含直链淀粉的柱子上纯化。 ⑶ 检测方式 在亲和柱上，可以利用纯化的融合蛋白以两种方式检测相互作用。一是将融合蛋白共价链接在树脂上，让抽提物过柱；二是把融合蛋白共价结合在珠子上，使抽提物和珠子混在一起。 ⑷ 优点 利用蛋白质亲和层析来检测蛋白质的相互作用有以下四个方面的优点： ① 灵敏度高：在高浓度固定蛋白质的条件下，可以检测微弱的相互作用（结合常数为10-5mol/L), 而生理上相关的最微弱的相互作用在10-3mol/L范围内。 ② 可以同时检测抽提物中所有的蛋白质，即所有蛋白质与固定蛋白质的结合机会均等。 ③ 通过构建突变体，可以检测与特异性相互作用有关的蛋白质结构域或关键的氨基酸残基。 ④ 可以检测多亚基蛋白质之间的相互作用。 ⑸ 出现假阳性结果的原因及部分消除办法 虽然蛋白质亲和层析技术能有效地检测蛋白质相互作用，但是也存在一些假阳性的结果，原因有以下几点： ① 电荷间的相互作用是带电性质相反的两种蛋白质相结合；可以用带相同离子电荷的对照柱来消除。 ② 通过B蛋白，A蛋白与亲和柱上检测蛋白质间接结合。 ③ 两种蛋白质的细胞定位不同，但是人为因素提供结合机会，有的甚至能高特异性结合。一个最著名的例子就是肌动蛋白与DNaseⅠ之间的高亲和力。 2.1.2 亲和印迹 蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到NC膜上，然后用特异性的蛋白质、肽段或配体来检测膜上的蛋白质。 该技术与Western blotting有些类似，只不过Western blotting是利用抗体的探针。 复杂的蛋白质混合物，如全细胞裂解液，通过该技术可以直接分析，而不需要纯化，因此，该方法特别适合于分析膜蛋白，如细胞表面受体。在凝胶电泳之前，可以先分离细胞裂解物以提高该方法的灵