感受态细胞的制备质粒DNA的转化和提取.doc

感受态细胞的制备 —LB液体培养基：胰蛋白胨，1%（W/V）；酵母提取物，0.5%（W/V）；NaCl，1%（W/V），用固体NaOH调节pH为7.0~7.2，分装于三角瓶中，灭菌后存于室温。摇动三角瓶，如果发现变浑浊，表明已染菌，应弃掉重新配制； —0.1 mol/L CaCl2：称取1.47 g CaCl2?2H20（Amresco分装）溶于100 mL去离子水中，灭菌后存于4℃； —离心管（50 mL或80 mL或100 mL），灭菌； —培养试管，灭菌； —1 mL枪头，灭菌； —1 mL加样枪； —滤纸，用牛皮纸包好后灭菌； —10 mL量筒，灭菌； —5 mL移液管，用棉花塞入管口，卷于报纸中灭菌； —冰，离心管架； —恒温摇床，可见分光光度计，比色杯。 1．接种空白大肠杆菌于3 mL LB培养基中，37℃剧烈震荡培养过夜； 2．将已培养好的种子液转入100 mL LB培养基中扩大培养至OD650=0.3后，将培养好的细菌置于冰上冷却1； 3．4℃，4 000 rpm离心10收集细菌，倒出上清，将离心管倒置于一干净滤纸上，将培养基控干； 4．用40 mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌，用加样枪冲吸，使菌体尽可能分散。冰上放置30； 5．4℃，4 000 rpm离心10收集细菌，倒出上清，再用4 mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌，这些细菌可以立即使用，或者于4℃放置12~24 h以增加其敏感性后使用。 6．如果证明所制备的感受态细胞可用，可以在冰上分装为100 μL每管，再加入100 μL甘油（注意：甘油非常黏稠，吸取时应该多一点。），于液氮或-70℃冰箱中存放。存于低温下的感受态细胞，一定不能融解。如果已经融解，应丢弃，而不能再冻结保存而继续使用。 注意事项： 1．本实验室所用空白大肠杆菌菌株为JM109。空白菌可以于平板上划线后，用Parafilm包好后存于4℃，也可将液体培养物存于4℃。但如果要长期保存，则应将细菌保存于50%的甘油中，存于-20℃或-70℃。当接种的细菌是来自于-20℃或-70℃存放的液体培养物时，接种应迅速，不等解冻，立即从表面刮下一块冰后，将菌种迅速放回低温存放； 2．一般于3 mL LB培养基中过夜培养12 h后，菌体已很浓，可以进行扩大培养。于100 mL培养基中培养2~3 h后，即可达到对数生长期。但有时如果由于存放过久，或者已经过数次解冻，造成细菌生活力下降，则倍增时间会延长； 3．对OD值的监测，当肉眼看到菌体已很浓时，于超净台上取3 mL测OD值。开始可以每30分钟检测一次，越到后面检测的时间就应该缩短； 4．感受态细胞的制备应该再严格无菌的条件下进行。因此，所有操作均应在超净台上。也可以在实验台上进行，但应在后面放一酒精灯，所有操作都不能远离火焰。最好每次恰好做感受态之前，将所有的枪头和管子都灭一下菌，用酒精棉球将加样枪的前端擦拭一遍； 5．感受态细胞的细胞膜比较脆弱，因此一当用冰冷的CaCl2悬浮以后，即不能剧烈震荡或快速抽吸； 6．根据我们的经验，纯度较高的含结晶水的CaCl2可以得到好的实验结果； 7．所有的枪头和管子均应干净。如果有可能，都尽量用新的。如果是用的回收的枪头，一定要看管壁是否干净。 8．扩大培养用的液体培养基体积可以调整。调整后的CaCl2溶液体积也按比例作相应的放大或缩小。 9．以本方法制备的感受态细胞的感受效率将随低温保存时间的延长而下降，所以最好是现做现用。存于低温下的感受态细胞应该在一个月内使用。而对于转化PCR连接产物，建议用其它的感受效率更高的制备方法。感受效率 质粒DNA的转化 —LB液体培养基：见感受态细胞的制备； —LB固体培养基：于液体培养基中加入1.5%的琼脂粉。不用在灭菌前溶化琼脂粉，灭菌完后，轻轻摇匀。注意不能剧烈摇动，否则可能会使培养基暴沸； —LB平板：将灭菌后的固体培养基冷至60℃左右时，倒入90 mm的培养皿中（约30 mL。如果先前已加入了抗生素，则还应在超净台上晃动培养皿几次； —200 μL枪头，1.5 mL Ep管，灭菌； —42℃水浴； —10 μL，200 μL加样枪； —培养试管，灭菌； —恒温摇床，恒温培养箱； —菌液推棒； —抗生素储液，本实验室所有的质粒筛选所用的抗生素有两类，氨卞青霉素（Amp）（储液，100 mg/mL，溶于无菌水中，工作浓度100 μg/mL，即每毫升培养基取1 μL储液）；四环素（Tet）（储液，5 mg/mL，先用1/2体积的乙醇溶解，再加入1/2体积的无菌水，工作浓度50 μg/mL，即每毫升培养基取10 μL储液。储液全部于-20℃保存）； —冰； 如果是冻存的感受态细胞，先于冰上溶解； 2．加入用于转化的质粒DNA 1 μL； 3．冰上放置30； 4．于4