柠檬精油纳米乳与乳酸链球菌素协同抗菌机制研究.docx

柠檬精油纳米乳与乳酸链球菌素的协同抗菌机制研究张子杰梁浩*（北京化工大学，化工资源有效利用国家重点实验室，北京，100029）通讯地址：北京市朝阳区北三环东路15号北京化工大学75号信箱，100029；Tel: +86-10Fax: +86-10E-mail: starslh@163.com摘要：本文以柠檬精油、乳酸链球菌素两种天然食品防腐剂作为抗菌活性物质，利用低能相转变法制备了同时包含两种抗菌物质的复合纳米乳体系，乳剂的粒径不大于20纳米，抗菌性能高且有效降低了两种抗菌物质的最小抑菌浓度（MIC），扫描电镜图像和菌体细胞溶出物的测定显示了抗菌体系对菌体细胞膜的破坏和作用机制。关键词：柠檬精油，乳酸链球菌素，纳米乳，抗菌，机制微生物引起的食品腐败问题长期以来威胁着人们的生活健康，造成食品生产、加工、销售行业严重的经济损失。为了降低损失和保证食品安全，各种各样的化学、合成防腐剂已广泛地应用到各个食品生产加工环节。但由于化学品的毒副作用使许多合成食品防腐剂使用受限，天然食品防腐剂研究日益备受关注。柠檬精油是从一些柑橘类果实中提取的主要成分，常作香味剂和天然食品防腐剂使用。其作用于多种食品相关菌种的优秀抑菌性能已经得到广泛证实。然而尽管已被广泛地用作食品防腐剂使用，由于柠檬精油易氧化分解和不溶于水的特性，使其活性成分不能充分得到利用，导致抗菌能力的降低。为了提高抗菌效果，研究者多采用纳米乳技术和联合其他抗菌剂协同提高抗菌能力的方法，然而将两种方法统一到一种体系的研究还未见报道过。乳酸链球菌素（Nisin），是由乳酸链球菌产生的一种多肽物质，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂。乳链菌素易溶于水且性能稳定，只对 G+菌有效果，而对G-菌、霉菌和酵母基本没有作用。本实验通过制备复合纳米乳体系，成功地将两种可联合增强但水溶性相反的天然抗菌剂统一到一个体系中，研究其抗菌性能和机制。1实验材料乳链菌素(104 IU/mL)，兰州伟日生物工程有限公司；柠檬精油，佛罗里达柑橘产品集团公司；吐温80、丙二醇、戊二醛、氯化钠、卡那霉素硫酸盐，国药集团化学试剂有限公司（北京，中国）；去离子水、超纯水为实验室自制。供试菌种：细菌：大肠杆菌(Escherichia coli) ATCC 8739、金黄色葡萄糖球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 6538、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ATCC6633；真菌：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ATCC 9763，均购自中国科学院微生物研究所(The Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences , IMCAS)。2实验方法2.1 相转变法制备纳米乳剂准确秤取一定量柠檬精油作为油相，加入6.0% 吐温80(w/w),混匀。将1,2-丙二醇与去离子水按照1:2的质量比混匀，添加一定量的乳链菌素，充分溶解，配成水相。将水相逐滴缓慢加入到油相中（1 mL/min），并不停匀速缓慢搅拌，之后匀速搅拌6小时，转速1300 rpm。2.2 纳米乳粒径测量利用马尔文Zetasizer Nano-ZS90激光粒度仪(Malvern, Worcestershire, UK)温度25°C，平衡时间60s，间隔时间10s，扫描5次得平均值。2.3 纳米乳浊度测定紫外分光光度计(Ultra-spec 2450 pro, SHIMADZU Ltd, Kyoto, Japan)，在600nm下测定OD值，测定纳米乳的浊度，重复三次求均值。2.4 抗菌性能测定2.4.1菌体培养与菌悬液的配制供试细菌和真菌分别使用牛肉膏蛋白胨培养基和YPD培养基。活化菌体接种于相应的液体培养基中，培养至对数期（细菌8-10h，酵母12-16h）。用无菌水倍比稀释到105-106 CFU/ml，备用。2.4.2最小抑菌浓度(MIC)的测定采用试管梯度稀释法测定最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)。加入定量的柠檬精油或乳链菌素或纳米乳体系，进行梯度稀释。最后，向每个试管中加入50μL菌悬液。同时设立对照组。培养24h（酵母48h）后将完全抑制菌落生长的最低浓度定义为最小抑菌浓度。2.4.3柠檬精油和乳链菌素协同抗菌性能研究测定采用棋盘稀释法。柠檬精油按横向稀释，乳链菌素则按纵稀释，形成浓度梯度降低，之后向每个试管中加入50μL菌悬液。培养24h（酵母48h）后，测定MIC。棋盘稀释法的结果采用组分抑菌浓度指数FICI(Fractional inhibitory concentration indices)进行评价。2.5