植物细胞悬浮发酵产活性物质的研究进展.doc

植物细胞悬浮发酵产活性物质的研究进展 摘要：本文概述植物细胞悬浮培养技术研究进展，讨论植物细胞悬浮规模培养技术，展望该技术在开发活性物质研究中的应用前景。 关键词：植物细胞；细胞悬浮培养；活性物质 随着人们对“膳食与健康”的认识不断深入，植物生物活性物质的研究与开发一起了全世界的关注。众多科学家基本上已经公认植物生物活性物质对人类的“康乐”状态的维持以及诸多现代慢性疾病的预防具有重要的作用。某些活性成分对人的心脑血管系统、神经系统、免疫系统、代谢系统等具有生理活性，在抗炎、抗病毒、抗衰老、抗肿瘤等方面均有预防和治疗作用[1]。而且人们对化学合成品的忌讳以及对天然化学品的崇尚，也使得全世界把目光投向植物来源的诸多生物活性物质，期望能找到可以代替目前医药中广泛使用的诸多化学合成品的植物天然物质。 由于生态环境的破坏、无计划的采伐和栽培技术等原因而致使珍稀濒危植物种类不断增加，而当前植物活性物质的获得主要从这些植物的皮、茎、叶中通过化学方法提取和分离，不仅造成植物资源的破坏，而且作为新型药剂的临床研究以及保健品等的开发，特别是推广应用的数量受到限制。因此，研究利用植物细胞悬浮培养发酵技术生产活性物质对大规模商业化生产植物活性成分具有重要的现实意义。 一 植物细胞悬浮培养发酵活性物质研究概况 在植物组织培养研究中，发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物和生物碱、色素、甾体、萜类等药用成分及香精等，其中有些是微生物和人工不能合成的活性物质，有些则是在整株植物含量甚微或本身资源就十分匮乏，而在培养的细胞中含量有时却很高[2]。因此，利用植物细胞培养技术生产有用代谢产物，已成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域。而以悬浮培养植物细胞直接发酵生产活性物质的研究又成为这一领域的新热点。 植物细胞悬浮培养是在完全人工控制的条什下进行，具有以下优点：不受地区、季节、士壤及有害生物的影响，可以周年生产且生产周期较短：通过改变培养条件和选择优良培养体系得到超过整株植物产量的代 产物，例如通过新疆紫草的细胞培养获得了比原植株含量高6倍的紫草素，甘草悬浮培养细胞中所含的甘草酸铵含量高于其他材料；可利用基因工程或创新的合成路线，对有效成分的合成进行遗传操作，提高所需次生代谢产物含量；也可进行生物反应器细胞培养，大规模生产有效的次生代谢产物[3-6]。 目前用于细胞培养的植物有200多种，可产生500多种有效成分，如培养人参细胞生产保健药物人参皂甙、紫草植物生产疗伤药物紫草宁、黄连细胞生产抗菌药物小蘖碱、长春花细胞生产阿吗碱、紫松果菊细胞生产免疫活性多糖、红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇等。从细胞培养中得到的药用成分有：喜树碱、莨菪碱、小蘖碱、全宁、地高辛、天仙子胺、胆固醇、利血平、山萆、芥皂疳元、胰岛素等：实现规模化生产的有：中国科学院植物研究所的紫草培养、华中理工大学的红豆杉培养和中国药科大学的人参培养[4]。 二 单细胞悬浮体系的建立 挑选生长力旺盛、表面有颗粒突起、疏松易碎的愈伤组织，并用镊子尽量夹碎后转入液体培养基，液体培养基在摇床(1O0～120 r／min)上连续振荡培养使细胞分散，得到细胞悬浮液。悬浮培养细胞的生长曲线为S型，元宝草细胞生长分为延滞期(0～4 d)，对数生长期（4～10d)和静止期(10～18 d)，元宝草在一个培养周期内细胞鲜质量可增加5倍左右[7]。对数生长期后，由于培养基中的营养物质减少，细胞代谢积累了大量有害物质，使细胞生长环境发生变化，导致细胞生长速度减慢。因此，继代培养应选择在对数生长末期或静止期初进行。悬浮细胞培养周期一般为14~20d。黄山药悬浮培养20 d左右生长量达到最大。保持新鲜培养基适当的比例也是必要的，继代过程中如接种量大，若养分不足，致使细胞死亡数增多[8]。油樟细胞悬浮培养过程中，在细胞生长量最高期, 待细胞沉淀后, 倾去上部培养液,添加新鲜培养液继代, 经2次继代培养后取下三角瓶, 静置30分钟, 待较大块愈伤组织沉淀后, 用无菌移液管吸取5 mL上层液,移入新鲜培养基中继续在摇床上进行连续振荡培养, 以获得单细胞或小块愈伤组织悬浮液。通过显微镜观察检测单细胞及细胞团的存在[9]。通过不断选择获得分散性好的细胞悬浮物，经过6代以上的转接，建立稳定的悬浮细胞系。 三 提高植物细胞悬浮发酵过程中活性物质 1 筛选高通量植物细胞株 在不同属植物中均可能发现同种生物活性物质或者其衍生物，但不同种之间，活性物质及其衍生物的含量有显著差异。因此获得一高通量的植物细胞株是是活性物质生产的基础。一般说来，选择活性物质含量高的植物可获得高产细胞系。但不同环境，不同季节，同种不同个体间的植物，其活性物质的含量都不同。产活性物质的植物的针叶、幼茎、形成层、种胚等均可诱导出愈伤组织，其中以幼茎为最