斑替枝孢生物学特性及致病性初步的研究.docVIP

斑替枝孢生物学特性及致病性初步的研究 加州鲈鱼(Micropterus salmonides)原名大口黑鲈,分类学上属鲈形目(Perciformes),太阳鱼科[1],身体长而侧扁,稍纺锤形,横截面为椭圆形。全身覆盖银白色或淡黄色细密鳞片,但脊柱颜色较深,通常呈绿青色或淡黑色,同时沿侧线附近常有黑色斑纹。腹部呈灰白色。背肉稍厚,墨绿色,体侧青绿。生活在淡水湖泊,原产自美洲,1983年引进中国进行养殖,通过人工驯化后,性格较温和,不喜欢跳跃,容易受到惊吓。加州鲈鱼通常可以在1%以下的咸淡水域中正常生长,水质要求每升水溶氧量在1.5 mg以上,比鲈鱼、鳜鱼耐低氧能力强[2]。鲈鱼肉是高蛋白食物,维生素A和维生素B丰富,滋补肝肾,健脾和胃,而且对感冒止咳有很好的功效,能化痰止咳,含有丰富的微量元素钙、镁、锌、硒等。加州鲈鱼生长迅速,肉质鲜美,容易养殖,且经济效益高,是中国常见的淡水养殖品种。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科,是中国重要的淡水养殖鱼类,它和鲢、鳙、青鱼一起,构成了中国着名的“四大家鱼”[3]。 本研究所用菌株是从患病加州鲈鱼体表分离,通过分子鉴定和形态鉴定,初步鉴定为斑替枝孢(Cladosporium bantianum),属真菌门(Fung)半知菌亚门(Deuter omycota)丝孢纲(Hyphomycetes)丛梗孢目(Miniliales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢属(Cladosporium)。能引起皮肤暗色丝孢霉病[4],尤其侵染脑部引起脑囊肿或脓肿,少数为脑膜炎[5]。在PDA和PCA培养基上生长迅速,菌落扁平。鼠灰色绒毛状,中央高凸,呈纽扣状,表面有不规则皱褶,37 ℃生长良好。在Sabourand培养基上,菌落稍大,灰棕色绒毛状,背面黑色。菌丝灰棕色,分生孢子椭圆形、梨形、链生[6]。 为研究斑替枝孢的生物学特性和对其他淡水鱼类的致病性,本试验通过不同pH和不同温度条件对该真菌的生长状况和菌落大小的影响,研究该真菌的生物学特性。同时将该真菌回复感染草鱼和鲤鱼,观察真菌对草鱼和鲤鱼是否具有致病性,为淡水鱼类的中草药防治提供一定的理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 该菌株分离自患病加州鲈鱼体表溃烂处,在PDA培养基上纯培养,将获得的纯培养菌株保存于5 ℃冰箱备用。菌株的分离与鉴定见魏福伦等[6]的报道。 1.2 方法 1.2.1 不同pH对斑替枝孢的影响 将该真菌接种在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的PDA培养基上,在25 ℃下恒温培养,观察真菌菌株的生长状况,每隔24 h观察一次,采用十字交叉法测定真菌菌落直径并记录下来。每个梯度做3个平板,试验周期为15 d。 1.2.2 不同温度对斑替枝孢的影响 将该真菌接种在PDA培养基上,在温度为5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下培养,观察真菌菌株的生长状况,测量其直径记录下来。每个梯度做3个平板,测量方法同上。试验周期为14 d。 1.2.3 斑替枝孢的致病性 用于回复感染的淡水鱼是草鱼和鲤鱼,取自乌江网箱[7]。取回后置自然条件下培养,待鱼在自然环境中生长状况稳定后进行回复感染。每组10尾鱼装到养鱼箱中,每次试验3箱鱼,一箱为对照组,另两箱为试验组。对照组将真菌菌株接种在鱼胸鳍下,放进鱼箱中培养。试验组一箱鱼直接刮入真菌菌株进行培养,另一箱鱼在鱼胸鳍下接种真菌菌株。每24 h观察一次,观察该菌对淡水鱼是否具有致病性。记录每天的观察结果,试验周期为20 d。 1.2.4 数据分析 用SPSS_Statistics-v19.0win32软件进行差异性计算,用SPSS软件的单样本t检验计算t值及Sig.(双侧)值。将Sig.(双侧)值与p值进行比较,p值表示概率,得出差异性是否显着。 2 结果与分析 2.1 不同pH对斑替枝孢的影响 由表1、图1可知,斑替枝孢在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的条件下均能生长。由表1可知,t值各不相同,但Sig.(双侧)值均为0.000,小于显着水平0.05,与t检验的零假设相符,即不同pH之间菌落生长速率存在显着差异(接种菌饼均为2 mm)。pH 9.0时,真菌生长速度最快,菌落直径达52.3 mm,菌落最为致密,pH 7.0、8.0时,真菌生长速度也相对较快,菌落直径分别达51.3、52.0 mm,因此最适生长的pH为9.0。 2.2 不同温度对斑替枝孢的影响 真菌的生长状况在不同温度下有明显的差异,在温度低于5 ℃和高于35 ℃时,均不能生长(接种菌直径为2 mm)。在10~30 ℃范围内,该菌的生长速度随温度的升高而增快,在20 ℃时生长速度相对较快,菌落直径达61.7 mm,菌落