中华根瘤菌Sinorhizobiumsp.1128自体诱导物合成酶基因的克隆及对.docVIP

ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q 中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128自体诱导物合成酶基因的克隆及功能曲媛杨梦华郑会明钟增涛*朱军(南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室南京 210095)摘要：Sinorhizobium sp. 1128中克隆自体诱导物合成酶基因，从而研究该基因在Sinorhizobium sp. 1128群体感应系统中的作用。【方法】利用基因序列同源性比对以及分子克隆的方法，从中华根瘤菌Sinorhizobium sp. 1128中克隆自体诱导物合成酶基因；利用大肠杆菌异源表达、C18反相薄层层析(TLC)Sinorhizobium sp. 1128生理功能的影响。【结果】以草木樨中华根瘤菌Sinorhizobium medicae WSM419自体诱导物合成酶基因Smed_1560序列设计引物，通过PCR扩增在Sinorhizobium 1128中寻找到一新的自体诱导物合成基因，命名为traI2。该基因在大肠杆菌Escherichia coli DH5?中表达两种自体诱导物分子。在Sinorhizobium sp.1128中缺失，自体诱导物活性下降回复突变后，自体诱导物活性得到恢复，结瘤实验结果表明该基因能影响根瘤菌的结瘤效率。Sinorhizobium sp. 1128群体感应系统是一个复杂的交互系统，它对结瘤的生理功能具有一定的影响。 关键词：Sinorhizobium sp. 1128；群体感应；自体诱导物合成酶单细胞细菌通过产生可扩散的小分子量信号分子用于细胞间的通讯，这一现象被称为“群体感应”（Quorum sensing）[1,2]。目前已经有多种微生物相关的化学信号分子被发现，这些物质大体可分为三类：一类是氨基酸和短肽类,主要作用于革兰氏阳性细菌，另一类是脂肪类的衍生物，主要作用于革兰氏阴性细菌。大多数(但非全部)都属于N-酰化高丝氨酸内酯(AHL)[3]。第三类信号分子是二酮哌嗪类化合物(DKP), 已在Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. alcaligenes, Enterobacter agglomerans 和Citrobacter freundii中发现[4]。在此三类信号分子中AHLs 的多样性最为丰富，而且在不同的细菌中其调控的生理性状也各不相同，因此对AHLs 的生物学特性研究也最为复杂和有趣。 根瘤菌存在的群体感应系统通常是多层次复杂的交互的。目前对豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum bv.viciae）群体感应系统的研究最为详细。它含有4个群体感应系统（rai,rhi,cin和tra），产生6种AHLs分子（包括一个特殊的C7-HSL）[5]。苜蓿根瘤菌CNPAF512菌株的rai 和cin 基因定位在染色体上共产生7 种AHLs这些AHLs 影响苜蓿根瘤菌的生长[6]。中华苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）Rm1021的基因组序列完成后, 发现了与luxR/luxI 同源的另一组基因命名为sinR/sinI系统[7]。进一步研究发现, 该系统负责一些新的AHLs的合成, 如C12-HSL, 3-oxo-C16∶1-HSL , C18-HSL等。汪洋等[9]进行的中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128自体诱导物合成酶基因的筛选研究发现了一个自体诱导物合成酶基因traI，它与草木樨中华根瘤菌Sinorhizobium medicaeWSM419的LuxI类自体诱导物合成酶(autoinducer synthase ) TraI的同源性高达99，将其缺失后发现缺失株仍能产生部分信号分子。而通过基因序列同源性比对分析发现，S. medicae WSM419 中共有个自体诱导物合成酶基因，因此我们推测中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128中还可能存在其它的自体诱导物合成酶基因。本研究以S. medicae WSM419的一个自体诱导物合成酶基因Smed_1560序列为模板设计引物，通过PCR扩增获得了中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128的另一自体诱导物合成酶基因traI2，通过对该基因的缺失研究它在中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128群体感应调控过程中发挥的作用，对进一步了解中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128的群体感应系统奠定基础。 1 材料方法 1.1材料 1.1.1菌株质粒: 表1本试验所用菌株和质粒。 表1 　本研究中所用的菌株和质粒 Table 1 　Bacterial strains and plasmids used in t