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实验二十 日本血吸虫病实验室诊断技术 日本血吸虫病是一种人畜共患的寄生虫病，被世界卫生组织列为全球重点防治疾病之一。它严重威胁着疫区人和动物的健康和生命安全，给畜牧业带来巨大的经济损失。在我国，本病严重流行于长江流域及其以南13个省、市、自治区。家畜如牛、羊、猪感染日本血吸虫后，不仅祸害自身，更重要的是作为人体血吸虫病的主要保虫宿主，为传播本病起了重要作用。大量调查研究表明，家畜是血吸虫病流行最主要的传染源和污染源。控制传染源是综合防治疫病、扑灭疫情的重要环节，而控制传染源的前提是确诊传染源。因此，应用灵敏、快速、经济的诊断方法确诊传染源，己成为日本血吸虫病流行病学调查、疫情监测、以及控制其流行和扑灭疫情必需解决的问题，这样才能做到有的放矢，减少在人力、物力和财力等方面的浪费。 当前对于日本血吸虫病的诊断方法已有大量的报道，根据本科教学的需要，下面介绍几种本科阶段应该掌握或者需要了解的实验室常用的日本血吸虫病诊断方法。 一、实验目的及要求 1.熟悉日本血吸虫卵和毛蚴的形态特征。 2.掌握血吸虫病虫卵检查方法。 3.掌握血吸虫病毛蚴孵化方法。 4.了解血吸虫病的几种常见的血清学（免疫学）诊断方法。 二、实验器材 (一)病原学诊断 1．直接涂片法。 （1）检验材料：新鲜动物粪便； （2）试剂：50%甘油水溶液或普通水； （3）器材：载玻片、滴管、盖玻片、显微镜。 2．沉淀法。 （1）检验材料：新鲜动物粪便； （2）试剂:普通水； （3）器材:专用乳白色塑料粪杯、竹筷、铜筛、滴管、金属环、载玻片、显微镜（普通离心机）。 3．浮法33％的硫酸锌溶液(脱氯处理)； （3）器械：专用乳白色塑料粪杯、竹筷、铜筛（40目/英寸）、尼龙筛网兜（260目/英寸）、塑料袋、长颈烧瓶（或三角瓶）（500ml）、脱脂棉、天平、温箱。 (二)血清学(免疫学)诊断 1．环卵沉淀试验（COPT）。 （1）检验材料：新鲜动物血清； （2）试剂：血吸虫冻干虫卵、标准阳性血清、标准阴性血清； （3）器材：滴管、载玻片、盖玻片（24×24mm）、蜡杯（熔蜡用）、玻璃蜡笔、脱脂棉、有盖盘、酒精灯、温箱、计数器、显微镜。 2．间接血凝试验法（IHA）。 （1）检验材料：动物血清； （2）试剂：生理盐水、蒸馏水、血吸虫病血凝抗原、标准阳性血清、标准阴性血清； （3）器材：96孔微量血凝板、25μl和100μl微量移液器。 3．胶乳凝集试验（LA）。 （1）检验材料：动物血清； （2）试剂：PAPS血吸虫病快诊液、标准阳性血清、标准阴性血清、生理盐水、蒸馏水、磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.2）； （3）器材：12×16cm玻璃凝集反应板、25μl和100μl微量移液器、手术剪刀、洁净纸、冰箱、中性滤纸（2.5×2.5cm）、2ml一次性注射器。 4．斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）。 （1）检验材料：动物血清。 （2）试剂：三联斑点酶联免疫吸附诊断试剂盒（浙江省农业科学院畜牧兽医研究所）、生理盐水、吐温20、30%过氧化氢。 （3）器材：5ml或10ml试管（多支）、试管夹、镊子、50ml或100ml烧杯（多个）、100ml量筒、温箱、50ml棕色试剂瓶、25μl和100μl 微量移液器、小纸片多条。 5. 免疫印试验2）主要试剂样本缓冲液：含甘油10ml，2-巯基乙醇5ml，10%SDS 30ml。转印缓冲液（TB）：Tris 3g，甘氨酸14g，甲醇250ml，加水至1000ml。Tris缓冲盐水（TBS）：10mmol/L，Tris含0.9%NaCl，用1N HC1调pH至7.4。TBS-T液：TBS液内含0.05%Tween-20TBS液。猝剂：1%～5%BSA或0.1%～0.3%Tween-20TBS液。氨基黑染液：0.1%W/V氨基黑（C. I. 20470），45%V/V甲醇，10%V/V冰醋酸。脱色液：90%V/V甲醇，2%冰醋酸。转移电泳仪，硝酸纤维素膜，滤纸，剪刀，手套，小尺1.直接涂片法。粪便中虫卵数量多时可采用直接涂片法检查。用滴管在载玻片表面加50%甘油水溶液或普通水1—2滴，取黄豆大小的被检粪块放入液滴内，混匀，剔除粗粪渣，加盖盖玻片，显微镜下镜检虫卵（见图20-1）。 2．沉淀法虫卵的比重大可沉集于水底，离心沉淀法检出。取粪便20～30g、加水成混悬液，经金属筛（40～60孔）或2、3层湿纱布过滤，再加清水冲洗残渣；过滤粪液在容器中静置25，倒去上液，重新加满清水，以后每隔15～20换水一次（3～4次），直至上液清晰为止。最后倒去上液，取沉渣作涂片镜检。 离心沉淀法将上述滤去粗渣的粪液离心（1500～2000rpm）1～2，倒去上液，注入清水，再离心沉淀，如此反复沉淀3～4次，直至上液澄清为止，最后倒去上液，取沉