硅胶包裹纳米铽荧光微粒的研制.doc

纳米稀土荧光材料与时间分辨荧光免疫分析 作 者：叶志强, 谭明乾 指导教师：袁景利, 王桂兰 一室101组 摘要：在油包水型的微乳液中，合成了三种形状规则、尺寸均匀的硅胶基质纳米稀土荧光材料。与前驱体相比，新型荧光纳米微粒具有更强的荧光强度和抗光漂白性能。将纳米微粒表面修饰并标记链酶亲和素SA（或抗体）后应用于时间分辨荧光免疫分析，建立了人血清中前列腺特异抗原（PSA）、甲胎蛋白（AFP）和乙肝表面抗原（HBsAg）的高灵敏度检测方法。 关键词：荧光纳米微粒；稀土配合物；生物标记；时间分辨荧光免疫分析。 时间分辨荧光生物分析技术是基于稀土荧光化合物特殊荧光性质而建立起来的一种高灵敏度分析方法 ，现已广泛应用于免疫测定、DNA杂交测定和荧光显微镜成像测定等生化检测的领域1。该技术利用具有荧光寿命长、Stokes 位移大和半峰宽窄等特点的稀土荧光配合物作为标记物，不仅适用于多标记分析，而且可完全消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的干扰，从而实现超高灵敏度分析。基于这些优点，时间分辨荧光生物分析技术在近20年来取得了重大的发展，在临床医学与生命科学的实践与研究中发挥着重要的作用。 近年来，纳米尺度发光材料在生化分析领域中的作用受到了越来越多的关注。量子点2、胶体金3、核壳型荧光探针4等纳米颗粒作为标记物已经开始应用于生化检测领域。但是由于纳米尺度的发光粒子的瑞利、拉曼和丁达尔散射产生的背景光对测定的严重干扰,影响了检测结果的灵敏度、精密度和准确度，无法实现高灵敏的定量分析。 在我们的研究中，综合稀土荧光标记物和纳米技术的优势，合成了三种具有长寿命荧光的纳米稀土荧光微粒5-7。新型纳米荧光微粒用于时间分辨荧光生物分子分析，不仅可从根本上彻底消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的干扰，提高分析方法的灵敏度,而且由于荧光配合物被包覆在硅胶的骨架结构中,基本隔绝了外部环境对配合物的影响，极大地增强了荧光材料的光稳定性。 实验部分 1.掺杂型纳米荧光微粒的制备 将160 mg N,N,N1,N1-[2, 6-bis(3’-aminomethyl-1’-pyrazolyl)-phenyl- pyridine]tetrakis(acetate)-Tb3+ （BPTA-Tb3+）溶于1.1 ml的水后和200 μl的四乙氧基硅（TEOS）搅拌下加入到100 ml的圆底烧瓶中，然后再分别加入2.37 g Triton X-100、1.87 g 正己醇和7.25 g环己烷，制成W/O型微乳液，在剧烈搅拌下向其中加入含有2.37 g Triton X-100、1.87 g正己醇、7.25 g环己烷及200 μl浓氨水的另一种微乳液。室温搅拌反应24小时后，加入50 ml丙酮结束反应。将反应液离心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸馏水各洗三次，真空干燥后得到白色硅胶包裹BPTA-Tb3+纳米荧光微粒。 2.掺杂型纳米荧光微粒用于测定人血清样品中的PSA 将含抗人PSA单克隆抗体（10 μg/ml）的pH值为9.6的0.1 mol/L的碳酸钠缓冲溶液50 μl分注于96微孔板的各孔中，4 oC, 24小时包被后，将PSA标准溶液（用5% BSA-0.9% NaCl-0.1% NaN3的pH值7.8的0.05 mol/L Tris-HCl溶液制备）或血清样品45 μl注入上述包被后的微孔板中。37 0C，1小时反应后，用含有0.05% Tween 20 的pH值7.8的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液（缓冲溶液1）洗两次，再用pH值7.8的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液（缓冲溶液2）洗一次，然后加入45 μl生物素标记的抗PSA抗体溶液，37 0C，1小时反应后，用缓冲溶液1洗两次，缓冲溶液2洗一次，再加入45 μl 纳米微粒标记的SA溶液，37 0C，1小时反应后，用缓冲溶液1洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。 3.共聚合型纳米荧光微粒的制备 将160 mg BPTA-Tb3+溶于1.1 ml的水后和200 μl的TEOS搅拌下加入到100 ml的圆底烧瓶中，然后再分别加入2.37 g Triton X-100、1.87 g正辛醇及7.25 g环己烷，制成W/O型微乳液，在剧烈搅拌下向其中加入含有2.37 g Triton X-100、1.87 g正辛醇、7.25 g环己烷及200 μl浓氨水的另一种微乳液。室温搅拌反应5小时后，加入6 μl的3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino]propyl- trimethoxysilane（AEPS），继续搅拌19小时后，加入50 ml丙酮结束反应。将反应液离心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和二次蒸馏水分别洗三次，真空干燥