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幻灯片1 第二章 基因工程的酶学基础 Enzymes 幻灯片2 第一节 限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease） 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 幻灯片3 1. 来源 原核生物。 2. 性质 内切酶。 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 3. 功能 自我保护作用。 细菌的限制和修饰系统（R/M体系） 幻灯片4 （1）限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。 幻灯片5 （2）修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基 幻灯片6 幻灯片7 二、限制性内切酶的类型 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 幻灯片8 1. I型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。 （1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC 幻灯片9 （2）切割位点 在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。 Recognize site cut 1-1.5kb （3）作用机理 需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 幻灯片10 2. II类限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ （1）识别位点序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。 幻灯片11 （2）切割位点 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如： EcoR I 5’-G?AATTC-3’ 3’-CTTAA?G-5’ Pst I 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTC-5’ 产生粘性末端 EcoR V 5’-GAT?ATC-3’ 3’-CTA?TAG-5’ 产生平齐末端 幻灯片12 （3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点） G?AATTC 5’- -3’ CTTAA?G 3’- -5’ 5’- G AATTC -3’ CTTAA G 3’- -5’ 幻灯片13 ② 3’端凸出（如Pst I切点） CTGCA?G 5’- -3’ G?ACGTC 3’- -5’ 5’- -3’ CTGCA G 3’- -5’ G ACGTC 幻灯片14 （4）粘性末端的意义 ①连接便利 i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。 ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 幻灯片15 幻灯片16 ② 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 幻灯片17 （4）同裂酶（Isoschizomers) 识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ① 完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。 Hind Ⅲ 5’-A?AGCTT-3’ 3’-TTCGA?A-5’ Hsu I 5’-A?AGCTT-3’ 3’-TTCGA?A-5’ 幻灯片18 ② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。 Xma I 5’-C?CCGGG -3’ 3’-GGGCC?C-5’ Sma I 5’-CCC?GGG-3’