组织切片技术.docVIP

取材与固定 1. 取材 在熟悉动物解剖结构的基础上,根据实验目的,有选择地取得新鲜的组织和器官.取材动作要轻而迅速,所取的材料要小而薄,并立即投入生理盐水漂洗. 2. 固定 固定的目的是尽量保持组织的生前状态,防止组织变化.固定时根据实验所需选择适当的固定剂.常用的固定剂见表1.固定组织所需固定剂量至少应大于组织块容积的20倍.固定后组织具有一定的硬度,易于处理且不易变形,同时组织可显示不同的折光率,有利于染色观察. (二)固定后的处理 凡固定剂固定过的组织均要经过冲洗或漂洗、脱水、透明或媒浸及包埋等步骤处理才能切片。 漂洗 固定后用流速适中的流水冲洗，有的组织在固定后要换用酒精定时定量漂洗，以洗去固定后组织所附的固定液。 脱水 选用适当的脱水剂置换组织内所含的水分，使组织块内不含水分。常用的脱水剂为：酒精、二氧陆环、丙酮、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃等。 有用脱水剂脱水时为了达到将水分逐步置换的目的，将脱水剂配成几种浓度，按浓度从低到高逐级脱水，以酒精为例，组织从70%浓度开始脱水，然后转入95%酒精及无水酒精各换2-3次。应注意脱水要适当，脱水过度会使组织变脆，脱水不足会影响后面的工序。 (三)透明或媒浸 脱水后还需借助某种有机溶剂将残存的水分完全置换，有时还需用一定量的高浓度脱水剂与该有机溶剂混合使用一次。 经石蜡包埋的组织经过这道工序呈半透明状，因此称为“透明”，而火棉胶包埋的组织未呈半透明状，称为“媒浸”。 常用的透明或媒浸剂为：苯、甲苯、二甲苯、香柏油、氯仿、丁香油、四氯化碳、石油醚、松油醇、乙醚与无水酒精等量混合配成的火棉胶媒浸液等。 (四)包埋及切片 1.石蜡包埋及切片 该法是组织学技术的常用方法,通常将透时剂中取出的组织放入1/2甲苯和1/2蜡中2h以后在纯蜡内换3次每次1h.。选用熔温为56-58℃的石蜡作包埋。 浸蜡完成后将组织制成包埋蜡块，将标签插入蜡边。 蜡块制成后进行修整，将蜡块修成方形（组织切片面朝上），或略呈梯形。组织四周留3-4mm空隙，将蜡块贴于木托上。 用旋转式切片机切片，用毛笔从蜡片带背面托起蜡片带，背面朝下放在盘中，并加盖、贴片。 将已分离的蜡片放在已涂有蛋清甘油和加数滴水的玻片上，略加热使蜡片展平、晾干。 2.火棉胶包埋切片法 组织脱水后入无水酒精24-28h，再入无水酒精-乙醚等量混合液24-28h,再经5%、10%及20%浓度的火棉胶各1周浸胶后，用最后浓度的火棉胶包埋组织块，将包埋组织块放入氯仿至火棉胶块硬化，泡于70%酒精备切片。 该包埋法的切片采用滑动式切片机，操作过程在组织块面上滴加70%酒精，切片刀凹面向上加满70%酒精，该法可切大块组织及较硬组织。 (五)染色 染色可分为活体染色和固定染色。 活体染色 采用无毒性染料，通过吞噬细胞摄取染料进行染色，常用的染料为台盼蓝、台盼红或墨汁。另外活体染色还可从活体动物取出的组织成分用特异性染料染色，常用染料为美蓝坚那绿B和中性红。 固定后染色 如上组织经固定、切片贴片进行染色，根据实验需要选择染液（表2）进行染色。 表1 常用固定剂配制 名称 配法 10%福尔马林液 37%-40%福尔马林液10ml,加90ml蒸馏水 福尔马林生理盐水液 37%-40%福尔马林液10ml,加氯化钠0.85-0.9g再加蒸馏水90ml 福尔马林钙溶液（用前配制） 37%-40%福尔马林液10ml,加氯化钙2g再加蒸馏水至100ml 中性缓冲福尔马林液（NBF液） 37%-40%福尔马林液10ml,加蒸馏水90ml，再加磷酸二氢钠0.4g和磷酸氢二钠0.65g 福尔马林缓冲液（Carson改变液，1973） 37%-40%福尔马林液10ml,加普通水90ml，再加磷酸二氢钠1.86g和氢氧化钠0.42g 福尔马林-溴化铵液 37%-40%福尔马林液15ml,加蒸馏水90ml，加溴化铵2g，再加蒸馏水85ml Helly固定液 氯化汞5g，重铬酸钾2.5g,硫酸钠(Na2SO4·10H2O)1g,蒸馏水100ml,用前临时加37%-40%福尔马林液5ml. Zenker固定液 配法同Helly,唯用前不加福尔马林液而加5ml醋酸 Susa固定液 蒸镏水80ml,37%-40%福尔马林20ml,冰醋酸4ml,三氯醋酸2g,氯化汞4.5g,氯化钠0.5g Bouin固定液 苦味酸饱和水溶液75ml,37%-40%福尔马林25ml,冰醋酸5ml Gendre固定液 苦味酸95%酒精饱和液80ml,37%-40%福尔马林15ml,冰醋酸5ml Rossman固定液 苦味酸无水酒精液90ml(4.9g苦味酸加无水酒精100ml),中性浓福尔马林(约40%)10ml Muller液 重铬酸钾2.5g,硫酸钠1g,