组织匀浆的制备.docVIP

组织匀浆的制备1、取组织块（0.2g~1g）最少可到2～5mg，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5或10ml的小烧杯内2、用移液管量取预冷的匀浆介质（ph7.4,0.01mol/L Tris-HCL, 0.0001MOL/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖0.8％的氯化钠溶液）或者用0.86％冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用移液管或移液器取总量的2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中）。3、匀浆的方式有多种：手工匀浆、机器匀浆、超声匀浆、反复冻融。手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。取少量组织匀浆做涂片（直接涂片、染色均可），显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可以延长匀浆时间或增加冻融次数。4、将制备好的10％匀浆用普通离心机或低温低速离心机3000r/min左右离心10～15分钟，若检测ATP酶，则只需要1000转/分，离心5分钟，将离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种测定。 可溶性抗原(soluble antigen)的制备及鉴定 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸等均为可溶性抗原，它们有相当部分来源于组织和细胞，成分复杂。制备这类免疫原时，首先须将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的蛋白或其他抗原，提纯的抗原需鉴定后才能用做免疫原。? 关键词：可溶性抗原可溶性抗原solubleantigen糖蛋白脂蛋白细胞匀浆 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸等均为可溶性抗原，它们有相当部分来源于组织和细胞，成分复杂。制备这类免疫原时，首先须将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的蛋白或其他抗原，提纯的抗原需鉴定后才能用做免疫原。 一、组织匀浆的制备 用于制备免疫原的材料必须是新鲜或低温保存的。材料获得后立即去除包膜或结缔组织，脏器应进行灌洗，去除血管内残留的血液，用含0.5g/L NaN3的生理盐水洗去血迹及污物；在4水浴或冰浴中将洗净的组织剪成0.3～0.5cm3小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机筒内制成组织匀浆。组织匀浆经3000r/min离心10min后，上清液作为提取可溶性抗原的材料。上清液在提取前还必须进行离心去除细胞碎片及微小的组织。 二、细胞破碎 提取细胞的可溶性抗原，需将细胞破碎。根据细胞类型不同，选择破碎的方法也有一定的差异，现介绍几种常用的细胞破碎方法。 1、酶处理法 溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等在一定的条件能消化细菌和组织细胞。如溶菌酶对革兰阳性菌的细胞壁有溶菌作用。酶处理法适用于多种微生物细胞的溶解，该方法具有作用条件温和、内含物成分不易受到破坏、细胞壁损坏程度可以控制等特点。 2、冻融法 细胞主要因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度突然改变而破坏。其方法是将破碎的细胞置-15～-20冰箱内完全冻结，然后从冰箱取出，让其在30～37中缓慢融化。如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被破。此法适用于组织细胞，对微生物的细胞作用较差。 3、超声破碎法 这是利用超声波的机械振动而使细胞破碎的一种方法。由于超声波发生时的空腔作用（cavitation），使液体局部减压，引发液体内部流动，在漩涡生成与消失时，产生很大的压力而使细胞破碎。超声波所使用的频率从1～20kHz不等。进行超声破碎时，需间歇进行，避免长时间超声产热，导致抗原破坏。也可将超声粉碎的细胞置于冰浴降温。超声破碎细胞，方法简单，重复性较好，且节省时间。微生物和组织细胞的破碎，均可采用此方法。 4、表面活性剂处理法 在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，通过细胞膜