细菌感受态的制备和质粒的转化.docVIP

细菌感受态的制备和质粒的转化 实验目的 通过实验学会感受态细胞的制备方法和DNA转化的最基本操作，以及如何提高转化效率的思路。本实验综合因素较多，难度较大，是分子生物学中的一个很关键的实验手段。 实验原理 转化是指某一细胞系由于接受了外源DNA，而导致其原来的遗传性状发生改变，这种遗传性状包括遗传型和表型的改变。 感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态。用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落。 ? ? 本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5?，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子。 实验材料和试剂 ? 大肠杆菌DH-5? 质粒pUC118（ampicillin，AmpR）??? （二）培养基和试剂 1. LB液体培养基(%) 胰蛋白胨（Tryptone） 0.5 酵母浸出粉（Yeast extract） 1.0 NaCl 0.5 pH 7.2～7.4（用2mol/L NaOH调节） （分装：20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。3ml/试管，每组2管。0.07Mpa高压灭菌30分钟）。 2. LB固体培养基 LB液体培养基加入1.6%的琼脂粉即可。? （分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。0.07Mpa高压灭菌30分钟）。 3. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin,，Amp），配制成100mg/ml备用。 4. 0.1mol/L CaCl2溶液? (配制方法：称取1.1克无水CaCl2，溶于90ml蒸馏水中，定容至100ml，装于250ml三角瓶中，0.07Mpa高压灭菌30分钟，4℃保存。） （三）器材 接种针 10ml移液管 50ml塑料离心管 5ml移液管 90mm培养皿 1ml移液管 1.5ml Eppendorf管 200?l吸头 三角爬 15×150试管 冰块 试管铝帽 牛皮纸 纱布盖 线绳 硫酸纸 （四）仪器 净化工作台 摇床机 恒温水浴锅 离心机 培养箱 以下均需无菌操作 （一）感受态细胞的制备 1. 大肠杆菌DH-5??冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB固体培养基平板上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）。 2. 从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜（约16小时）。 3. 取0.3ml菌液接种于20ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养2～3小时，待OD600值达到0.3～0.4时，取下三角瓶，立即置冰浴10～15 分钟。 4. 将细菌转移到一个灭菌的50ml离心管中，4℃ 3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。 5. 加入20ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀，置冰浴中30分钟。 6. 4℃ 3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。 7. 再加入2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。在4℃冰箱中放置12～24小时，即可应用于DNA转化。 （二）细菌的转化 1. 取大肠杆菌DH-5?新鲜感受态细胞100?l于1.5ml Eppendorf管中，加入50～100ng质粒pUC118 DN