质粒DNA的提取鉴定.doc

实验三 质粒DNA的提取鉴定 一、原理 质粒是细胞质中独立于染色体之外的能自主复制的遗传单位。基因工程中的质粒一般是指细菌质粒，它可以随着细菌的细胞分裂将自己的遗传特性稳定的遗传给后代细胞。广义的质粒还包括霉菌、蓝藻和酵母质粒以及动植物细胞中的线粒体和质体等。细菌质粒是环状双链DNA分子，其他少数质粒是线性DNA分子，而酵母的杀伤质粒则是RNA。环状质粒的DNA分子具有超螺旋性质，长度可以从1kb到200kb左右不等。质粒中除了复制、转录等相关的必需序列外，有一些DNA区段对于细菌来说并非必需序列，通过体外操作以目的基因取代这些非必需区段，这种改造的质粒就成为外源基因载体。 按照质粒载体的用途和其外源DNA的遗传信息能否表达可分为中间克隆载体（如pMD18-T）和表达载体（如pET-X、pBI121等）。克隆载体所连接的的DNA片段一般没有启动子，因而不能转录，主要用于目的片段的大量制备。表达载体按照宿主的不同有各种各样的原核表达载体（如大肠杆菌）和真核表达载体（如酵母、动物和植物），目的基因在载体上有完整的启动子和终止子调控，可以在宿主细胞中转录并翻译成蛋白。 根据质粒在宿主细胞中复制调控机制的不同，可分为两类：一类是“松驰型”质粒，如pMB1/colE1复制子，其复制受到一种称为RNAII的分子正向调控，不需要任何质粒编码的蛋白质，完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，因此即使在氨基酸饥饿或添加氯霉素等抗生素抑制蛋白质合成的条件下，其复制仍不停止，即所谓的“松驰”方式复制，其在宿主细胞中拷贝数较多，一般如常用的pUC系列可达500～700个；二是“严紧型”质粒，如pSC101，其复制伴随着RepA蛋白的合成，因此一旦蛋白质合成受阻，其拷贝数就不能增加，即在宿主的“严紧”控制下复制，其在宿主细胞中拷贝数通常仅有1~5个。在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用的是“松驰型”质粒；但在某些特殊原因（如表达产物对细胞有毒性）下要求用严紧型质粒。 图2 质粒DNA图谱 质粒DNA的分离提取主要有三个步骤：①宿主细胞分离或快速繁殖。质粒DNA常以酵母或细菌为宿主细胞。在一定培养条件下，酵母或细菌生长呈S形曲线，一般认为，处于对数生长晚期的细菌细胞壁容易裂解，质粒DNA提取效率高。对于常用的pUC系列质粒，由于其复制调控机制上的原因，细菌在37℃或42℃下培养，其拷贝数较多，30℃时，拷贝数会大大降低②细胞的收集和裂解。通过低速离心可以将培养液中的菌体收集起来。收集的菌体通过一定物理（如超生波）或化学方法（如强碱、变性剂）处理使细胞裂解，从而可以将胞内的质粒DNA释放出来。酵母细胞裂解比细菌要困难一些。③质粒DNA的纯化。借助物理（如密度梯度离心）和化学（碱法）的方法将质粒DNA以外的细胞壁、染色体DNA、RNA和蛋白质等杂质去除，可以获得纯的质粒DNA。 细菌裂解常利用去污剂（如SDS）和变性条件（如高温、强碱）使细菌细胞壁和细胞膜裂解，释放出细胞内容物，溶菌酶预处理有助于提高细胞壁的裂解效果（作用于细胞壁肽聚糖）。然后根据变性的染色体DNA和质粒DNA由于拓扑学特征的不同，造成的复性热力学特征不同，将其分开。在碱性条件下，变性的染色体DNA和破裂的细胞壁、细菌蛋白等缠绕成大型复合物，并被SDS包盖，复性缓慢，当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中沉淀出来，而闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开，当条件恢复正常时，迅速复性，形成天然的超螺旋分子，因此可通过离心技术将两种类型的DNA分开。 质粒DNA的纯化经典的方法有碱法和氯化铯-溴乙啶密度梯度离心。通过氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心直接将蛋白质、缺口环行或线性DNA、封闭环行质粒DNA和RNA分离开来。碱法利用聚乙二醇（PEG）沉淀核酸，LiCL选择性沉淀去除大分子RNA，RNaseA消解小分子RNA，再用苯酚、氯仿等蛋白变性剂结合离心将溶液中的残余蛋白质沉淀出去。溶液状态的质粒DNA用有机沉淀剂（乙醇、异丙醇）或结合无机沉淀剂（NaAc、NH4Ac等）就可以沉淀出来。其他纯化方法还有电洗脱法、羟基磷灰石柱层析法，Sepharose2B凝胶过滤法等。 影响质粒DNA产量的因素主要有寄主菌株遗传背景、质粒拷贝数和分子大小。 大肠杆菌质粒DNA分子自然状态下是共价闭合环状DNA（cccDNA）。但在DNA提取过程中，由于细菌正处于对数生长期，加之提取过程是在剧烈裂解条件下进行，提取到的DNA一般可能包括以下几种构型：超螺旋（scDNA，复制完成）、套索DNA（复制进行中）、开环DNA（ocDNA）、线性（LDNA）等，在琼脂糖电泳中由于泳动速率不同可以观察到多条电泳谱带，谱带的先后顺序、相对距离主要决定于构