【2017年整理】物理因素对细菌遗传诱变效应的遗传分析.docVIP

中央民族大学生命与环境科学学院 遗传学综合性设计实验报告 2012年5月20日 一、实验目的 1.了解物理因素对遗传物质的影响； 2.熟悉紫外线诱变的原理和方法； 3.掌握微生物的紫外线诱变技术。 二、实验原理 微生物菌种质量优劣对发酵工业具有至关重要的作用，由于自然界中的菌种一般在生产 上都有不同程度的缺陷，而且自然突变频率低，突变幅度小，单纯依靠自然界中微生物群体来进行的自然选择有很大的局限性，往往不能满足实际生产的需要。因此现在的微生物发酵生产菌种绝大多数都是经过人工改造的，而菌种改造有诱变改造和基因改造两方面。虽然现在基因工程菌已经成为越来越重要的菌种改造方式，但通过物理化学诱变对菌种品质进行改造仍然是工业生产菌重要的来源。 诱变分为物理诱变和化学诱变。物理诱变采用紫外光、X射线、?射线、?射线、?射线、 快中子和超声波等，其中紫外光诱变因其效果好、实验设备简单等优点而成为应用最广泛的物理诱变剂。而化学诱变则是采用一些可以和DNA起作用，改变其分子结构，最终引起遗传改变的化学物质对诱变对象进行处理，得到诱变菌种的方法。实验室中常用的有亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝酸胍等（这3种诱变剂诱变效果依次增加，毒性也依次增大）。 物理诱变往往被分为电离辐射和非电离辐射，常用的电离辐射有X射线、?射线、? 射线、快中子等。电离辐射的特点是穿透力强，对生物作用分为直接作用和间接作用。辐射的直接作用是指辐射所产生的直接物理损伤，是由于能量量子直接与染色体作用而造成的原始损伤，是一种物理作用；而辐射的间接作用则是一种化学作用，是由于生物细胞中的水分子受到辐射作用产生各种自由基，这些自由基和溶质分子或直接和染色体发生作用产生遗传损伤。由于不同作用的时效差别，辐射的作用过程大体可分为物理、物理化学、化学和生物学效应等4个阶段，时效发生可以从10-12s到几年。辐射中常采用的剂量单位为伦琴（R）。一个伦琴相当于在00C及101325Pa（760mmHg）下，每立方厘米干燥空气中能产生2.082?109个离子对的电离剂量。此外还有拉德（rad）、尔格（erg）、居里（Ci）等单位。 非电离辐射最典型的就是紫外线，其电磁波谱位置为40~390nm。而由于DNA分子的紫外吸收峰位于260 nm。因而波长在200~300 nm之间的紫外线被用于紫外诱变。紫外诱变时的剂量与所用紫外灯管的功率以及照射距离和照射时间相关，实验中往往采用改变照射时间来改变照射剂量。由于照射致死率在95%~99%的时候回复突变株出现率最高，因而实践中多用70%~80%的致死率进行诱变。 枯草芽孢杆菌的多数都能产生大量的淀粉酶，较易得到分离。由于芽孢具有较强的抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中使芽孢杆菌得到很好的富集。利用该菌产淀粉酶的特性，选择以淀粉为碳源的分离培养基，菌体分泌的淀粉酶会使菌落周围的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周围出现清晰的透明圈。根据透明圈的直径（C）与菌落直径（H）之比（C/H）可初步鉴定酶活力的高低，即比值越大酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。, 一是测定底物淀粉的消耗量, 有粘度法、浊度法和碘一淀粉比色法等二为生糖法, 测定产物葡萄糖的生成量三例, 从而计算出淀粉的量, 推算出淀粉酶活力。试剂为色原底物分解法, 四是酶偶联法。其中碘淀粉比色法测淀粉酶活力操作简便迅速, 实用。碘一淀粉比色法淀粉经α-淀粉酶催化水解, 生成产物为葡萄糖、麦芽糖及糊精, 在底物淀粉浓度已知且过量的条件下, 反应后加人碘液与未被催化水解的淀粉结合成蓝色复合物。其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较成比例从而计算出淀粉的量，推算出酶活力。 本实验以枯草芽孢杆菌为材料，选择紫外线为诱变剂，进行诱变处理：观察菌种的产酶能力的变化并计算致死率。 三、材料、仪器、试剂 1、实验材料： 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ） 2、实验试剂： 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，淀粉培养基； 试剂：碘液； 仪器及器皿：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、离心管、涂布器、移液管、移液器、接种针。 3、处理时间： 0 s,15s ,30s ,60s,120s, 240s； 4、培养皿数目：总计46个，34个普通培养基，10个淀粉培养基，2个用于放大头针（1个）； 5、涂布棒：共计15个，3个用于初始菌悬液计算浓度，12个用于紫外照射后涂布计数。 6、配制2管无菌生理盐水。 四、实验步骤 第1天的实验内容： （1）清洗60个平板，将平板放入高压蒸汽灭菌锅灭菌。 （2）配制900mL