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鸡新城疫抗体滴度的检测（红血球凝集抑制法）1 红细胞血凝与血凝抑制的原理红细胞凝集的实质是红细胞膜上的特异性抗原(凝集原，agglutinogen)和相应抗体(凝集素，agglutinin)发生抗原抗体反应。当病毒的悬液中先加入特异性抗原，且这种抗原的量足以封闭病毒颗粒或其凝集素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其凝集素直接接触，这是红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制，也称为血凝抑制反应。新城疫病毒属于副黏病毒属，是最主要的红细胞凝集性病毒，具有神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)，可使红细胞凝集。2 实验材料鸡新城疫抗原(NDV，南京天邦生物科技有限公司)；生理盐水；肝素钠；96 孔 V 型微量血凝板；微量移液枪3 红细胞凝集3.1 1%鸡红细胞悬液的制备取无免疫过的成年公鸡，翅静脉采血 10~15 mL，肝素抗凝，2000 r/min 离心 10 min，弃上清，注意要将血细胞泥表面的一层薄膜洗净。然后用血细胞泥 5~10 倍的PBS洗涤，2000 r/min 离心 10 min，弃上清，如此反复洗涤 3 次至上清液透明，弃上清液后得到红细胞泥。再用PBS配成 1%鸡红细胞悬液（红细胞泥：PBS=1ml:100ml）。4℃保存，不超过5d。3.2 红细胞凝集(4 单位抗原的滴定)在 96 孔微量血凝板上，从左到右每空各加 50 μL 生理盐水，另加一排作为重复。再向每排的第 1 孔加入 50 μL 新城疫抗原，依次向后倍比稀释直至第 11 孔，第 12 孔作为对照，无抗原液。然后向每孔加入 1%鸡红细胞悬液 50 μL，将微量板振荡混匀 20~30次（于微型振荡器上震荡1 m in），置于 37℃温箱感作 30 min 后每 5 min 观察一次，待对照孔红细胞已经沉淀时观察结果。结果观察：将反应板倾斜 45 度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动着为沉淀，表明红细胞未被凝集或不完全被病毒凝集；如果红细胞铺平孔底，凝集成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。以 100%凝集的抗原最大稀释孔位该抗原的血凝价，即 1 个凝集单位；从该孔向前移 2 孔的抗原稀释度作为 4 单位抗原的稀释度。抗原应稀释的倍数=血凝滴度÷4 (若血凝价为 26，病毒抗原应稀释倍数为 24（16），即16ml生理盐水+1ml抗原即为 4个单位血凝单位的病毒抗原)。4 红细胞凝集抑制在 96 孔微量血凝板上，从左到右每孔中各加 50 μL 生理盐水，再向每排的第 1 孔加入 50 μL 待测血清，依次向后倍比稀释直到第10 孔，然后向每孔加入 50 μL 4 单位抗原，振荡混匀 20~30 次，置于 37℃温箱感作 20 min。取出再向每孔中加入 1%鸡红细胞悬液 50 μL，振荡混匀 20~30 次，置于 37℃温箱感作 20 min 后每 5 min 观察一次。结果判定：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度，用被检血清最大稀释度的倒数或以 2 为底的对数(log2)表示，如某份血清的最高血凝抑制稀释度为 1:128，则该血清的 HI 抗体滴度为 128 或 7(log2)。当鸡的血清 HI 抗体滴度超过1000 时，可判定为新城疫感染。