201092_第四次分子生物学研究方法.pptVIP

６　巢式PCR（nested PCR） 巢式PCR是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两 轮PCR扩增反应。 在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物 在内引物的存在下进行第二轮扩增。 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个 靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的序列很少） 增加了扩增的可靠性和敏感性。若用于检测则可增加检 测的可靠性。 二　PCR的应用 PCR技术问世以后，立即引起广泛的兴趣与重视，很快在 全世界范围内得到广泛的应用和发展，迅速进入遗传性 疾病的基因诊断、传染病病原体的检测、法医学和考古 学等领域 研究 基因克隆，DNA测序，引入突变等 诊断、检测 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 　－遗传性病症的诊断、癌基因检测 法医 犯罪现场标本分析、亲子鉴定等 其他…… 2)基因检测 A’ 内源性病变基因 正常人 A 病 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等 地中海贫血 珠蛋白链合成不平衡 A 正常人 病 人 正常 病人 PCR-RFLP法： 限制性内切酶 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） Ras基因 突变 限制性内切酶 正常 突变 电泳 3)基因鉴定 女性 男性 Y引物 PCR 男性 女性 法医学分析 个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 5.5 RNA 干扰 RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象。 由于RNAi可以作为一种简单、有效的基因沉默工具，因而在医药开发、基因治疗和功能基因组研究等方面的应用得到飞速发展。 一、RNAi现象的发现； 二、RNAi的基本原理； 三、RNAi技术的应用。 主要内容 RNAi是后基因组时代非常重要的研究工具。 2006年的诺贝尔生理学奖获得者： Andrew Z. Fire Craig C. Mello 二、RNAi的基本原理 RNAi是一个依赖ATP的过程，一种称为Dicer的核酸酶负责将dsRNA酶切转化为3’端有2～3nt突出、长21～23bp 的小分子双链RNA ，这种RNA称为小干扰RNA（siRNA）。siRNA形成之后，与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体(RISC)，此复合物通过碱基互补配对识别靶mRNA 并使其降解，从而导致特定基因沉默。 靶基因mRNA siRNA的反义链 RNAi是生物体抵御外源遗传物质入侵的自我 保护机制。 mRNA被酶切破坏，性状无法表达。 RNAi效应具有两个明显的特征，特异性和高效性。干扰的高效性提示在机制中存在信号放大的步骤。许多研究显示RNAi过程中有新的dsRNA分子的合成，当siRNA反义链识别并结合靶mRNA后，siRNA反义链可作为引物，以靶mRNA为模板在依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRP) 催化下合成新的dsRNA，然后由Dicer切割产生新的siRNA，新siRNA再去识别新一组mRNA，又产生新的siRNA，经过若干次合成切割循环，沉默信号就会不断放大。正是这种称为靶序列指导的扩增机制赋予了RNAi的高效性和持久性。 siRNA Dicer核酸酶 特异性蛋白结合，siRNA解链 活化的siRNA复合体(RISC) 靶基因的mRNA siRNA Dicer核酸酶 核酸酶降解mRNA RdRP 催化合成新的双链RNA（dsRNA） 以反义siRNA为引物 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 三、RNAi技术的应用 （一）.功能基因组的研究； （二）.疾病治疗； （一）.功能基因组的研究 随着一些物种基因组计划的完成，科学家急需一种新的、快速的方法解读基因的功能和基因的表达机制以及基因之间的相互关系。而RNAi技术已成为解决这些问题的重要手段。 与其他方法相比，RNAi具有其独特的优点：①简单易行，容易开展；②与基因敲除相比实验周期短，成本低；③与反义技术相比具有高度特异性和高效性；④可进行高通量基因功能分析。 总之, 随着后基因组学时代的到来，RNAi技术将会成为功能基因组学研究的主要方法。 线虫基因组范围内高通量RNAi Clone genes into E. coli Expression vector that makes dsRNA ORF Feed Worm E. coli; Score phenotype E. coli 线虫：选取2500个基因进行RNAi实验，观察线虫的发育。发现700个基因的RNAi可导致胚胎致死，胚胎后致死，不育及形态异常等表型。 （二）.疾病治疗 RNAi可以直接