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第七章 固定化酶 缺点： 酶活力损失； 增加了酶的成本； 只适用于可溶性底物，尤其可溶性小分子底物，对大分子不适宜； 不适宜于多酶反应。 选择载体 应考虑： 载体的形式：薄片状、管状、纤维状、颗粒状等； 载体的结构：孔型、半透膜性和非孔型； 载体的性质：水溶性和水不溶性； 酶偶联量或装载量和实效系数。 无机（inorganic） 天然有机（organic from natural sources) 合成有机（organic synthetic materials) 酶固定化时遵循的原则： 维持酶的催化活性和专一性； 固定化应有利于自动化、连续化反应； 固定化酶应具有最小的空间位阻； 酶与载体必须牢固结合； 固定化酶应具有最大的稳定性； 固定化酶易与产物分离； 固定化酶成本要低； 充分考虑固定化酶在制备工程和应用中的安全因素。 非化学结合法 结晶法：使酶结晶从而实现固定化的方法。 分散法：将酶分散于水不溶相中而实现固定。 超滤反应体系 离子结合：酶通过离子键结合具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶等。使用注意：pH、离子强度、温度 物理吸附 通过氢键、疏水键、电子亲和力等物理作用 选择载体的原则 （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。 缺点：结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制 离子键结合法 通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。 使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等 。 固定化方法：条件温和，操作简单，在一定pH，T、离子强度下，酶液与载体混合搅拌几个小时/酶液流过处理好的离子交换柱，获得固定化酶。 应用：制备过程中，活力损失较少。但是，离子键结合力较弱，结合不牢固，在pH和离子强度等条件改变时，酶容易脱落。在酶催化反应时，要控制好pH、离子强度和温度等条件。 吸附法的优点 不发生化学反应，对酶活影响很小，无副作用。 固定化操作简单，条件温和， 容易再生，吸附剂可反复使用。 缺点： 作用力弱，容易泄漏，污染产物， 载体非专一性结合其他物质 被吸附的酶要过量，酶损耗大 解决途径： 开发新的载体 根据载体的性质对酶进行适当的化学修饰，以增加吸附力 共价结合法优点： 结合牢固，固定化酶的稳定性好，利于连续使用，不会因为反应条件等原因轻易脱落，应用和报道最多的一种方法。 缺点： 反应条件苛刻，操作复杂， 引起高级结构变化，破环活性中心，不易得到比活力高的固定化酶，酶活回收率30%， 底物专一性会发生变化。 1． 固定化对酶活性的影响 酶活性下降，反应速度下降 原因： 酶结构的变化、构象变化，影响活性中心氨基酸 空间位阻：活性中心对底物的定位 内扩散阻力：底物与活性中心的接近 包埋时被高分子物质半透膜包围，大分子底物难以进去。 个别情况：酶活提高，化学偶联使得到化学修饰。 2． 固定化对酶稳定性的影响 （1）操作稳定性提高 （2）贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3)热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4）对分解酶的稳定性提高。 （5）pH稳定性提高，明显优于游离酶 （6）对有机溶剂的稳定性提高 稳定性提高的原因： 吸附交联法： 酶先吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或大孔离子交换树脂， 再用戊二醛等双功能试剂交联，也称壳状固定化酶。 交联包埋法： 1st step:酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的聚合体。 2nd step：高分子或多糖类物质包埋成颗粒。 避免颗粒太细的缺点，固定化酶稳定性好。 反应条件激烈，酶多个基团被交联，活力损失大，颗粒小 比较牢固，可长时间使用 交联法 反应条件苛刻、操作复杂；活性中心、酶高级结构和酶专一性易受破坏 酶与载体结合牢固，不会因底物浓度高或存在盐而脱落 共价结合法 化学结合法 酶与载体结合力弱，酶容易脱落。 活性中心不易被破坏，高级结构变化少，操作方便，条件温和，载体价廉易得、可反复使用等。 物理吸附法 酶与载体结合力弱，容易受缓冲液或pH的影响，离子强度高时酶易脱落 操作简单、处理条件温和、酶活性中心氨基酸残基和酶高级结构不易被破坏，酶的回收率高 离子结合法 包埋时化学聚合反应，易导致失活，只适用于小分子底物和产物体系 不与酶蛋白氨基酸残基结合，很少改变酶结构，酶活回收率高 包埋法 酶分散不好将会引起传质效应，使酶的催化活力降低。 通过过滤或离心法将酶与介质完全分离，进而实现酶的再利用 分散法 在不断重复循环中，酶会有损耗，从而使固定化酶浓度降低 提供非常高的酶浓度，对于活力较低的酶来说具有很大的优越性；应用时可大大缩短反应时间 结晶法 非化学结合法 缺点 优点