融合蛋白技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的.pptVIP

融合蛋白及其应用 主要内容 融合蛋白的概念 融合蛋白技术概况 融合蛋白技术的临床应用 常见的几种融合蛋白 一、融合蛋白的概念 在基因工程迅速发展的基础上，有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起，进而表达所需蛋白，这种通过在人工条件下将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白(fusion protein，FP)。 二、融合蛋白技术概况 融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 （一）融合蛋白技术的特点 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋 白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。 （一）融合蛋白技术的特点 真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。 （二）融合蛋白技术的内容 构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 （二）融合蛋白技术的内容 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 （二）融合蛋白技术的内容 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化 。 （三）融合蛋白技术的关键 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 （三）融合蛋白技术的关键 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。 有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用， 并获得了满意的结果。 （三）融合蛋白技术的关键 但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋白时，应多选择几种融合方式， 从中优化出理想的连接方式。 另外，大量研究表明连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。 （三）融合蛋白技术的关键 遗憾的是，目前对于连接肽序列的设计还没有可靠的选择标准。现在，大多数连接肽序列的设计和选择仍主要依赖于直觉。尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产生了重大的进步，但是我们对于序列和结构之间的关系的了解还是很有限的。 三、融合蛋白技术的临床 应用 DNA疫苗 双功能酶（多功能酶） 定向药物 溶栓剂 抗菌肽 （一）DNA疫苗 目前，疫苗已经经历了三代： 第一代疫苗是用减毒或杀死的病原体来激活机体免疫系统； 第二代疫苗是用生物技术和重组DNA技术研制的组分疫苗注射机体诱导免疫应答； 第三代疫苗是直接注射基因重组的抗原基 因来激活人体免疫系统，即DNA疫苗。 （一）DNA疫苗 DNA疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势，如易于生产，稳定性强，成本低廉等，并可同时诱导体液与细胞免疫应答。 （一）DNA疫苗 DNA疫苗的免疫方法是将带有目的基因并能在真核细胞中表达的细菌质粒直接导入动物体内，通过在体内表达目的蛋白以引起机体对该蛋白的免疫应答。 （一）DNA疫苗 目前利用基因工程成功制成的多价重组抗体融合蛋白 CYF196(国内尚未上市)就是一种DNA疫苗， 它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因为CYF196对病毒的主要受体-位于呼吸道上皮中的细胞间黏附分子有高度亲和力，对鼻病毒感染有较强 的防御功能。 （二）双功能酶（多功能酶） 以往研究发现 ， 在利用基因融合所构建的大的酶分子中，如果用以构成融合蛋白的各个酶分子的整个编码序列均保留于新的酶分子中，则融合蛋白一般均保留所构成的酶分子各自的酶活性。 （二）双功能酶（多功能酶） 并且发现在这些新构建的融合蛋白中