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第三章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术 第二节 细胞组分的分析方法 用离心分离技术分离细胞组分 特异蛋白的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 定量细胞化学分析技术 利用物理或化学方法，对细胞组分进行定位、定性、定量分析。 一、超速离心分离细胞器、生物大分子及其复合物 二、特异蛋白的定位、定量与定性 蛋白电泳(SDS)与免疫印迹反应(Western-Blot)（间接定位）:可相对定量。 与差速离心法分离细胞组分结合。 免疫荧光技术（直接定位）： 快速、灵敏、有特异性。可用普通荧光显微镜或共焦显微镜观察、拍照。 四．定量细胞化学分析技术 ?细胞显微分光光度术(测量OD值） 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：紫外光显微分光光度测定法（OD260、280） 可见光显微分光光度测定法（OD600） 根据OD值计算DNA浓度（ug／mL）。公式如下：单链 DNA ［ssDNA］＝33×OD260 ×稀释倍数双链 DNA ［dsDNA］＝50×OD260×稀释倍数单链 RNA ［ssRNA］＝40×OD310×稀释倍数 ? 流式细胞仪（Flow Cytometry） ?主要应用： 定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异 蛋白的含量来： 1.测定细胞群体中不同细胞的数量（分类计数功能）； 2. 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞（分选功能）。 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 细胞的培养 细胞工程 一、细胞的培养 ?动物细胞培养 ? 类型：原代培养细胞（primary culture cell） 传代培养细胞（sub-culture cell） ?细胞系（cell line）：传代超过10代后的细胞。 ?细胞克隆（cell clone）：从某一细胞系分离出单个细胞，并由此增殖形成的，具有相同遗传性状的细胞群。 ?细胞株（cell strain）：特殊遗传标记或性质的细胞克隆。 ?植物细胞 ?类型：原生质体培养 （体细胞培养，用纤维素酶去掉细胞壁） 单倍体细胞培养（花药培养） 二、细胞工程 ?细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术：促融剂—灭火的仙台病毒或聚乙二醇（PEG）。 ?单克隆抗体（monoclone antibody）技术： 细胞工程 ?细胞拆合：用物理（短波光等）或化学（细胞松弛素B）方法把细胞核与细胞质分开，制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。再结合显微注射操作技术将不同来源的胞质体与核体相互组合，形成核质杂交细胞。 细胞拆合是克隆羊采用的技术。 第五节 模式生物与功能基因组的研究 一、模式生物 模式生物具有个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快的特点。 基于细胞的统一性，如遗传密码的通用性，和某些基因进化的保守性，简单细胞的生命活动规律可能提示高等细胞的生命活动规律。 大肠杆菌 优势：培养方便；生长快速；基因结构简单； 突变株的诱变、分离、鉴定容易； 用途：早期关于基因表达调控的研究成果，如乳糖操纵子的发现，是在大肠杆菌中取得的。现在多用做质粒构建与扩增的宿主菌；也用于蛋白的原核表达。 线虫 优势：基因组序列清楚；生命周期仅3天，繁殖速度快；身体透明；细胞个数清楚（959个，身长1mm）；易于进行遗传操作。 用途：广泛用于发育生物学研究，如细胞凋亡。于2006年获得诺贝尔奖的RNA干扰技术最初是在线虫中证实的。 斑马鱼 优势：容易饲养和繁殖，每次可产200个卵； 发育速度快，鱼卵产出后1天即可完成早期发育；发育过程中鱼卵和胚胎身体透明，易于观察。 用途：用于发育生物学研究。 拟南芥 优势：基因最小的植物；植株矮，高度约为30cm；易于培养； 生长周期短（6周），种子多。 用途：用于植物遗传学，发育生物学，功能基因组的研究。被誉为“植物界的果蝇”。对水稻、蔬菜等的研究有借鉴价值。 二、突变体制备技术 RNA干扰技术（RNA interfering， RNAi) ：利用小RNA瞬时或永久干扰RNA的稳定性或阻碍翻译过程，从而显著降低靶基因的表达(gene knockdown)。 最初在植物中发现，在线虫中证实，后迅速推广至绝大多数模式生物。此技术发明者2006年获诺贝尔奖。 基因敲除（gene knockout):删除基因组中某个基因的部分或全部序列，使该基因失活，