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益生菌联合肠内营养对腹腔感染大鼠不同部位肠道微生态及屏障功能的影响 研究生： 岳超 　 导 师： 赵允召　教授 研究依据 目前关于益生菌对肠道微生态及肠粘膜屏障的研究主要集中在某段肠道，缺乏不同部位肠道间的纵向对比 不同部位肠道加用肠内外营养对益生菌作用的影响作用尚不明确 随着分子生物学的发展，对肠道菌群结构及定量分析技术的发展，使本研究有成熟的技术基础 研究目的 本研究对腹腔感染大鼠模型分别实施肠外营养（PN）、肠外营养加肠内营养（EN）、PN加EN加益生菌，分别观察它们对不同部位肠道菌群改变、细菌易位、肠黏膜形态、跨膜结合蛋（occludin)肠上皮免疫球蛋白（IgA）水平以及对肠粘膜上皮紧密连接的影响，旨在为益生菌的临床应用提供理论和实验依据。 研究内容 DNA指纹图谱技术研究肠道微生态变化 1. PN组、PN+EN组、PN+EN+益生菌组肠道微生态改变的差异 2.各组内空肠、回肠、结肠肠道微生态的改变 研究内容 各组内空肠、回肠、结肠肠黏膜跨膜结合蛋白及IgA免疫组织化学(免疫组化)测定 电镜观察各组内空肠、回肠、结肠肠管肠粘膜上皮细胞间紧密连接情况 各组内分别取空肠、回肠、结肠对应肠管、肠系膜淋巴结做细菌培养，测定细菌异位率 取大鼠各段肠管肠系膜淋巴结组织，常规病理HE染色切片，着重观察肠管各层形态学变化特征； 预订的研究方法 实验对象：选择清洁级SD大鼠50只，由我院动物中心提供，雌雄不限，体重： 200--250g。 大鼠模型的制作：对大鼠进行腹腔麻醉后在无菌条件下钝性分离出颈外静脉，经颈外静脉置入软硅胶管，由颈背部皮下隧道引出。在空肠置入另一根软硅胶管，并将硅胶管沿腹壁皮下潜行由颈背部双侧肩胛之间皮下引出。采用盲肠结扎穿孔法制成腹腔感染动物模型。PN液、EN液以微量输液泵均匀速度输入。 研究方法 分组：实验分三组,每组8只 1.PN组（于第1~5天给予PN支持，热氮量100%由PN液提供，以微量输液泵保持输液速度约3.3ml/h静脉输入） 2. PN+EN组（于第1~5天PN、EN百普素空肠内滴入） 3. PN+EN +益生菌组（第1~5天内PN、百普素及益生菌空肠内滴入） 研究方法 PN加EN组和益生菌组热氮量的80%由PN液提供，恒速输注，其速度约为2.6ml/h，64ml/d,20%由百普素提供，约16ml/d。百普素在输入肠道前用生理盐水以2:1稀释至24ml，以1ml/h空肠内滴入。 益生菌组加用益生菌3~4ml/8h（上海交通大学昂立股份有限公司研究所提供）。 研究方法 益生菌主要成分为植物乳杆菌活菌及其代谢产物，活性为1*10cfu/ml,经空肠造瘘管注入约10ml/d，分3次/d 注入。 3组营养均提供等氮、等热卡，平均每天提供非氮热量348KJ，供氮504mg 研究方法 表1　PN液配方(每100ml溶液的含量) Table 1　PN solution (contents/100ml) 配方 剂量 50%葡萄糖(ml) 33 8·5%乐凡命(ml) 45 20%脂肪乳剂(ml) 17 水乐维他(ml) 1 安达美注射液(ml) 1 10%氯化钾(ml) 1 10%氯化钠(ml) 1 胰岛素(U) 4 肝素(U) 40 非蛋白热卡(kJ)　 435 总氮量(mg) 630 研究方法 检测指标 1.肠道菌群DNA指纹图谱分析:盲肠内粪便经TE缓冲液稀释,提取基因组总DNA,以大鼠粪便样本中的细菌基因组DNA为模板,以细菌ITS通用引物对PS2 (5-TG (C/T) ACA CACCGC CCG T-3)和PL2 (5-GGG T (G/C/T) CCC CATTC (A/G) G-3)为引物,进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳成像分析,以了解大鼠肠道菌群多样性。