植物生理实验报告.docVIP

本科学生综合性实验报告 ? ? ? ? 项目组长 高铭远 ? ??学号 07070241011 成 员 杜广宇、杜沙沙、段司宇、冯慧彬、宫亚坡 专??? 业 生物技术 ? 班级 ??1班 ? 实验项目名称 小麦耐盐生理指标测定 指导教师及职称 尉连伶 ? 讲师 开课学期 ?? 2008 ??至? 2009 学年 2 学期 上课时间 ? 2009 年 ? ?4 ???月? 22? ??日 植物耐盐性生理指标的测定 一、实验目的及要求 通过本实验的学习，使学生掌握脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量测定方法，掌握单因子方差分析，培养学生离心机和分光光度计的使用技能，为今后撰写毕业论文打下良好的基础。 二、实验主要仪器和试剂 仪器: 离心机；分光光度计；恒温水浴锅 试剂：酸性茚三酮溶液；冰醋酸；标准脯氨酸溶液；3％磺基水杨酸；过氧化物酶测定反应液；pH6.0磷酸缓冲液10％TCA；0.6％TBA 三、实验原理 植物在盐胁迫下,植物可通过积累一定量的脯氨酸降低水势, 维持植物体内的水分平衡,保证植物的正常生长。脯氨酸本身是一种水溶性最大的氨基酸，，它可以防止原生质体的水分散失，在植物细胞生理干旱时，它的增加有助于细胞或组织保持水分。用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。 植物在盐胁迫下，活性氧含量会明显增加，对植物体产生毒害，而过氧化物酶会清除植物体内多余的活性氧 。过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。 植物在盐胁迫下，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。 四、实验步骤 （一）实验材料的培养 小麦种子吸胀8h后消毒、4℃下春化30天，采用砂培法种植，至三叶期，作为供试材料。 （二）盐胁迫处理 用100 mmol/L NaCl对小麦进行盐胁迫，以未进行盐胁迫为对照，以进行盐胁迫为处理，盐胁迫3d后分别测定脯氨酸含量、过氧化物酶活性和丙二醛含量，对照和处理分别重复3次。 （三）脯氨酸含量测定 1.标准曲线的制作 用100μg/ml脯氨酸配制成2、4、6、8、10μg/ml的标准溶液。取标准溶液各2ml,加2ml3% 磺基水杨酸，2ml冰醋酸和4ml2.5% 茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色1h，冷却后与波长520nm测定A值，以A值为纵坐标，脯氨酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线。 2.脯氨酸的提取 称取小麦叶片0.5g，加3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取10min，冷却后，5000rpm离心20min，上清液即为脯氨酸粗提液。 3.反应体系 取上清液2ml，并加入1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮，混匀置于沸水浴中显色0.5h。以2ml磺基水杨酸，1ml冰醋酸，2ml酸性茚三酮为对照。在可见分光光度计下520nm处测得A值。 4. 脯氨酸的含量的计算 从标准曲线查得脯氨酸浓度，计算出样品中脯氨酸的含量，以每克材料鲜重含脯氨酸的微克数表示（μg/g）。 （四）过氧化物酶活性的测定 1.过氧化物酶的提取 称取小麦叶片0.2g，加5ml pH 6.0的磷酸缓冲液，再加入0.02g PVP-30（除去酚类物质的毒害，防止醌类物质的干扰）及少量石英砂研磨。4℃，5000rpm离心15分钟，上清液为酶粗提取液 2.反应体系 50μl酶粗提取液加入4ml反应液，在可见分光光度计下470nm处测A值，放入后立即记时，每隔1min记一次数值，连续记录三次，取平均值。 3.酶活力定义 过氧化物酶活性以每克鲜重每分钟在470nm下A值的变化值，设每变化0.01A为一个酶活力单位。过氧化物酶活性=U/min·g