时间分辨免疫荧光技术-李超要点.pptxVIP

时间分辨免疫荧光技术 演讲人：李超 2015年2月3日 主要内容 目前有哪些标记免疫学分析方法？ 什么是免疫荧光技术？ 什么是时间分辨免疫荧光技术？ 时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？ 时间分辨免疫荧光技术可应用于哪些方面？ 目前有哪些标记免疫学分析方法？ 免疫荧光分析(Coons, 1941) 放射免疫分析(Berson和Yalow, 1960) 酶联免疫分析 (Engvall, 1971) 胶体金标记免疫分析(Faulk和Taylor, 1971) 化学发光免疫分析(Arakawa， 1977) 时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979) 电化学发光免疫分析(Leland, 1990) 生物芯片(美国Luminex公司, 1997) 什么是免疫荧光技术？ 基本原理： 免疫荧光技术是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。 以荧光素作为标记物，与已知的抗体或抗原结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在的部位。 什么是时间分辨免疫荧光技术？ 概念： 时间分辨免疫荧光技术指利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。 什么是时间分辨免疫荧光技术？ 基本原理： 用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质； 当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度； 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的 什么是时间分辨免疫荧光技术？ 例如： 三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽 (Tb) ，镝 (Dy)等，它们的荧光光谱具有特异性强﹑ Stokes位移大﹑寿命长的特点； 采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2 连接； 在中性或接近中性pH 条件下，DTTA 与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu 又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地放大。 通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来 时间分辨免疫荧光技术的优势是什么？ 精确度上的优势: 放射免疫 （精度：10-12mol/L） 酶联免疫 （精度：10-9 mol/L） 胶体金标记 （精度：10-15mol/L） 化学发光 （精度：10-15mol/L） 电化学发光 （精度：10-17mol/L） 时间分辨荧光（精度：10-18mol/L） 生物芯片 （精度：10-18mol/L） 技术上的先进性 特点 特异性荧光与非特异性荧光分离度高 时间、光谱分辨 发射荧光与激发荧光分离度高 零背景、高特异性 解离、增强 荧光性大大提高 稳定的荧光螯合物 线性范围更宽 重复性更好 标记位点 标记位点多 对标记物结构及活性影响小 无衰变 受环境影响小 高稳定性，高精确度 试剂保存时间长 标准曲线保留时间长 标记方法 单、双标记 多标记 同一试剂盒可同时测多个项目 时间分辨免疫荧光分析相较于化学发光的优势 发光效率 重复检测 本底噪声 灵敏级数 标记物 标记位点 标准曲线 多标记 科研开发 时间分辨荧光 化学发光 95% 可无数次 零本底 10-18 原子 可达20个/抗体 稳定达一年以上 最多可达四标记 有 1% 不可重复 干扰大 10-15 大分子化合物 1个/抗体 稳定 2 到 4周 无 无 时间分辨荧光和电化学发光比较的优势 标记物 多标记技术 做科研 试剂种类 试剂价格 Eu, Sm, Te, Dy 有 能 58种临床,24种科研 低 钌 无 无 28种临床, 无科研试剂 高 时间分辨荧光 电化学发光 时间分辨免疫荧光技术优点总结 零本底、灵敏度高 线性范围宽 试剂有效期长 标准曲线稳定性好 易于自动化 对环境及人体没有任何影响 时间分辨免疫荧光技术的应用 内分泌检测 甲状腺功能检测 糖尿病指标检测 生长激素检测 T3、T4、FT3、FT4 、TSH-U、TBG 、Ab 、TPO Ab 胰岛素、C－肽 hGH（生长激素） 意义： 甲状腺疾病也是目前最常见最多发一种内分泌疾病，