乙型肝炎病毒X基因在涎腺腺样囊性癌中表达的实验研究.docVIP

乙型肝炎病毒X基因在涎腺腺样囊性癌中表达的实验研究 　　[摘要] 目的 探讨乙型肝炎病毒X基因（HBX）在涎腺腺样囊性癌（ACC）中的表达及意义。方法 选取2008年6月―2012年10月就诊于昆明医科大学附属口腔医院口腔颌面外科的涎腺肿瘤患者为研究对象。血清学结果HBeAg无论是阳性或阴性，以HBeAb阳性为HBV携带者或曾感染者。根据术后病理结果分为ACC组和对照组，采用免疫组织化学及聚合酶链反应（PCR）技术检测两组组织中HBX的表达。结果 HBX大多数表达于细胞质内，小部分表达于胞核内。HBX在ACC中表达强度强于涎腺腺淋巴瘤，二者间差异有统计学意义。结论 HBX在ACC的发生、发展中可能起重要作用。 　　[关键词] 涎腺腺样囊性癌； 乙型肝炎病毒； 乙型肝炎病毒X基因 　　[中图分类号] R 739.87 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.04.003 　　近年来，随着分子生物学研究的进展，越来越多的研究表明，全球8%～17%的肿瘤与病毒或细菌等慢性感染有关，如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）与肝癌[1]。然而HBV可感染身体其他部位[2-3]，在这些器官、组织和细胞中均可检测到HBV DNA。这说明HBV嗜肝性不十分严格，有一定的泛嗜性。研究[4-5]表明唾液中也可检测到HBV，涎腺组织也易感染HBV[6]。乙型肝炎病毒X基因（hepatitis B-virus X gene，HBX）对肝癌的发生、发展起重要作用，涎腺组织也易感染HBV，推测HBX在涎腺腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）中可能存在表达，且对ACC的发生、发展可能起着重要作用。本研究利用临床手术中保留的ACC新鲜组织标本，探讨HBX在ACC中的表达及其意义。 　　1 材料和方法 　　1.1 标本和方法 　　选取2008年6月―2012年10月就诊于昆明医科大学附属口腔医院口腔颌面外科的涎腺肿瘤患者为研究对象。经患者同意后，行HBV血清学检查。将临床手术中切取的部分新鲜涎腺肿瘤标本放入-196 ℃液氮罐中备用，根据血清学检查和术后病理结果将患者分为ACC组和对照组（涎腺腺淋巴瘤组），每组14例。每组中男6例，女8例，年龄26～53岁，平均42.5岁。无论血清学结果中HBeAg是阳性或阴性，以HBeAb阳性为HBV携带者或曾感染者[7-8]。 　　1.2 主要试剂 　　乙型肝炎病毒X抗体（Abcam公司，英国），通用型免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），总RNA提取试剂和Quant cDNA第一链合成试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。 　　1.3 免疫组织化学染色 　　取冻存的部分涎腺肿瘤组织行石蜡包埋，石蜡块作4 μm切片供免疫组织化学染色。SP免疫组织化学法检测涎腺肿瘤标本中HBX的表达，HBX抗体浓度配制为原浓度的1/200倍。以PBS代替一抗作为阴性对照。以肿瘤细胞胞浆出现棕黄色颗粒且着色强度高于背景非特异性染色者判断为阳性。在相同光源强度下，每张切片随机选取10个视野，每个视野下选取5张图片（×400），保存图像格式为TIFF。应用Image-Pro plus 6.0软件对图像进行分析，录制Macro中测量参数包括光密度矫正、平均光密度、面积最小值。取得每个视野的平均光密度值。 　　1.4 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-po- 　　lymerase chain reaction，RT-PCR）检测HBX 　　mRNA的表达 　　取冻存的部分涎腺肿瘤组织，提取总RNA，逆转录合成cDNA，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，β-actin为内参，PCR反应所用引物设计如下。HBX上游引物序列为5’-GGAAG-ACACAATGAAGAAT-3’，下游引物序列为5’-CA-CCACAGGAATATCAGT-3’，产物大小为169 bp；β-actin上游引物序列为5’-TGCGTGACATTAAGGA-GAA-3’，下游引物序列为5’-AAGGAAGGCTGGA-AGAGT-3’，产物大小为172 bp。反应条件为：95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s ，72 ℃ 30 s，共30循环，72 ℃延伸5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，采用BIO-RAD凝胶成像系统进行凝胶成像。应用Gel-Pro analyzer 4.0软件对PCR图像进行分析，分析涎腺肿瘤标本中HBX mRNA表达（光密度值）。分析前将图片色彩进行反转，重复3次，取平均值。 　　1.5 统计学处理 　　采用SPSS 13.0统计学软件对实验