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第八章 植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选 植物细胞悬浮培养体系的建立和愈伤组织诱导与植株再生 一、植物细胞悬浮培养的定义 植物细胞悬浮培养（Plant cell suspension culture），是指将植物细胞或小的细胞团（包括含少数细胞的小的分生细胞团或细胞聚集体）放在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养。这些细胞或小的细胞团来自愈伤组织，或某个器官或组织，通过物理或化学的方法进行分离而获得。 二、建立一个良好细胞悬浮培养体系应具备的条件 建立一个成功的细胞悬浮培养体系（简称悬浮细胞系）必须满足三个基本条件： ① 细胞或小的细胞团在液体中分散性良好，小细胞团在几十个细胞以下。很少有完全由单细胞组成的悬浮细胞系。 ② 均一性好，即细胞形状、大小及细胞团大小均匀一致。在倒置显微镜下观察，悬浮细胞系内的细胞团体积和形状比较一致。 ③ 液体培养基中细胞分裂旺盛，细胞生长迅速，一般2～3天生长量可增加一倍。 植物悬浮细胞系不仅为原生质体培养和人工种子的研制奠定良好基础，同时也为遗传转化提供良好受体，还可以用来生产植物次生代谢产物。因此，植物细胞悬浮培养是植物细胞工程技术中很有价值的技术手段。 三、建立良好悬浮细胞系的技术关键 影响建立良好悬浮细胞系的主要因素，见图6.1。 图6.1 影响建立良好悬浮细胞系的主要因素 1. 选择合适的基因型和外植体 （1）基因型 基因型是影响植物细胞悬浮培养成功的重要因素。有的基因型 容易诱导形成愈伤组织，用其为外植体进行细胞悬浮培养，细胞可 以进行分裂，并可持续分裂，进一步同步化后，获得悬浮培养细胞 系。但有的基因型则与之相反。因此，要重视起始材料基因型的筛选。 （2）外植体 选择合适的外植体是细胞悬浮培养成功的另一重要因素。外植体的选择对以后愈伤组织的诱导十分重要，是愈伤组织诱导的重要条件。合适的外植体诱导产生疏松易碎愈伤组织，对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。双子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶和叶片等；单子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、幼穗和花药等。根据大量的研究报道，无论单子叶还是双子叶植物均以幼胚（单子叶植物的幼穗也很好）为最佳，诱导的愈伤组织质量好，分化能力强。某些情况下用幼胚、下胚轴、子叶等可以直接进行细胞悬浮培养，如用大麦幼胚可以直接建立悬浮细胞系，并利用此细胞系获得大麦原生质体再生植株（颜秋生等，1990）。 东北农业大学小麦研究室曾用小麦幼穗诱导产生愈伤组织，再以愈伤组织为外植体成功地建立单细胞悬浮培养细胞系，进一步诱导培养获得再生植株（见图6.2），并对其后代的农艺性状、生化品质性状以及遗传稳定性进行研究。这充分表明体细胞无性系变异的存在和在作物品种改良中应用的可行性（李文雄，曾寒冰，胡尚连，1989～2002）。 1，2—同步化悬浮培养细胞分裂前；3—第一次正常分裂；4—非正常分裂的 第一次分裂；5，6—非正常分裂的第二次分裂；7～10—经多次分裂后 形成细胞团；11，12—愈伤组织；13—愈伤组织芽的分化； 14—由愈伤组织直接发生的再生植株；15—移栽的再生植株 图6.2 小麦单细胞培养与植株再生 （李文雄，曾寒冰，胡尚连，1996） 2. 诱导疏松易碎的愈伤组织 愈伤组织质量（外观和生理状态）直接影响悬浮细胞系的建立。最合适的愈伤组织应疏松易碎、外表湿润、颗粒细小，颜色为白色或淡黄色，经几次继代筛选后作为建立悬浮细胞系的起始材料。 诱导疏松易碎的愈伤组织，关键在于培养基类型、激素的种类和浓度，以及外植体本身和附加的有机物。对于禾谷类作物来说，适宜的外植体为幼穗、幼胚和花药，激素一般为2 mg/L 2，4-D（或附加0.5 mg/L BA、NAA或ABA），常以MS、B5或N6为基本培养基。在培养基中附加有机物有利于愈伤组织的诱导。如加入水解酪蛋白、L－脯氨酸、谷氨酰胺有利于疏松易碎愈伤组织的诱导，这主要是改变培养基中－N和NO3－－N的比例。它们的比例的改变影响愈伤组织的质量和状态。另一重要因素是培养基渗透压。培养基中蔗糖浓度为10～30 g/L时，有利于疏松易碎愈伤组织的形成，浓度较高时则易形成坚硬的愈伤组织和胚状体。 此外，调整继代时间间隔可使疏松易碎愈伤组织块生长迅速，很快从大块组织块中分离出来。因愈伤组织内部的细胞不均一，生理状态和生长速度也不相同，疏松易碎的小愈伤组织块常被包埋在大愈伤组织块内。 3. 选择合适的细胞悬浮培养基 用于细胞悬浮培养的培养基可参考愈伤组织诱导培养基，但有时并不完全适合细胞悬浮培养。当培养过程中细胞变褐、生长变缓时应重新选择培养基，包括选择培养基的种类，激素的种类、浓度、比例，以及有机附加物等。 对单子叶植物而言，一般选择MS、B5和N6培