有关Sabin 株脊髓灰质炎灭活疫苗在动物体内的安全性评价.docVIP

有关Sabin 株脊髓灰质炎灭活疫苗在动物体内的安全性评价 　　脊髓灰质炎(简称脊灰)是由脊灰病毒感染引起的以肢体麻痹为主的急性肠道传染病，儿童为主要易感人群。目前尚无有效的方法治疗脊髓灰质炎，接种脊灰疫苗是控制与消灭脊灰最重要且有效的手段。国内外应用的脊灰疫苗有两种：口服脊灰减毒活疫苗(oralpoliovirusvaccine，OPV)和脊灰灭活疫苗(inactivatedpoliovirusvaccine，IPV)。我国一直使用脊灰减毒活疫苗预防和控制脊灰，并且取得了十分显著的成绩。但是，口服脊灰疫苗存在潜在的疫苗安全性问题，由其引发的疫苗衍生脊灰病毒(vaccine-derivedpoliovirus，VDPV)和疫苗相关麻痹性脊灰病例(vaccineassociatedparalyticpoliomyelitis，VAPP)已超过了由野生型病毒引起的脊灰发病率。为配合WHO彻底消除脊灰病毒，减少因接种OPV引起的疫苗相关病例和衍生病例，研制IPV势在必行。然而，目前国际上实际使用的IPV均使用野毒株制备获得，对疫苗的生产环境、生产操作和质量控制等均具有较高的要求。在消灭脊灰的最后阶段，对脊灰野毒株的使用和管理更加严格。因此WHO推荐研发IPV的企业采用减毒的Sabin株生产IPV。本实验采用篮式生物反应器和片状载体技术培养Vero细胞制备Sabin株IPV(IPVderivedfromSabinstrains，sIPV)，并对疫苗的纯度、免疫原性及安全性进行了评价。 　　1材料与方法 　　1.1细胞及病毒 　　Vero细胞原始株来自欧洲动物细胞典藏中心(theEuropeanCollectionofAnimalCellCultures，ECACC)，经本公司自行传代，建立了主细胞库(139代)和工作细胞库(142代);Hep-2细胞悬液由本公司质量保证部提供;Sabin株脊灰病毒毒种由世界卫生组织(WHO)惠赠，经扩增传代建立工作代种子库(S0+3代);野毒株IPV(IPVderivedfromwildstrain，wIPV)由赛诺菲巴斯德公司提供，批号H0215-1，实验时距离失效期(2014年4月)时间为2年。 　　1.2实验动物 　　SPF级Wistar大鼠，30只，雌性各半，体重175～200g，购自北京维通利华技术有限公司，动物质量合格证号:11400700046;SPF级ICR小鼠，60只，雌性各半，体重18～24g，由北京昭衍新药研发技术股份有限公司提供，动物质量合格证号:11000500000180;SPF级雌性豚鼠，24只，体重283～362g，由北京昭衍新药研发技术股份有限公司提供，动物质量合格证号：11400500000474。 　　1.3主要试剂及仪器 　　Vero细胞残余蛋白含量检测试剂盒由本公司自制;牛血清白蛋白残留检测试剂盒购自无锡博生医用生物技术开发有限公司;兔抗脊髓灰质炎病毒多克隆抗体由本公司自制;人血白蛋白购自成都蓉生药业有限责任公司;篮式反应器和片状载体购自德国Eppendorf公司;层析柱购自美国GE公司。 　　1.4sIPV的制备 　　按照疫苗生产工艺，应用篮式反应器和片状载体37益，pH值7.4～7.6培养Vero细胞，待细胞长成致密单层时，分别按0.01MOI接种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型单价Sabin株脊灰病毒，33益，pH值7.4~7.6培养48~96h，收获病毒液，经超滤浓缩、柱层析纯化、灭活，按一定抗原含量(Ⅰ︰Ⅱ︰Ⅲ型为30℃90℃70DU/ml，0.5ml/剂)配制三价sIPV，对病毒纯化液及疫苗进行各项指标检定。 　　1.5疫苗中宿主细胞蛋白(hostcellprotein，HCP)、DNA及牛血清白蛋白残留量检测 　　按照《中国药典》三部(2010版)相关附录方法进行检测。 　　1.6纯度 　　参考《中国药典》三部(2010版)HPLC色谱法检测病毒纯化液纯度。 　　1.7特异性鉴定 　　1.7.1病毒形态观察 　　将纯化液中的病毒负染后，应用透射电子显微镜观察病毒形态。 　　1.7.2抗原性分析采用Westernblot法。取病毒纯化液经SDS分离后，电转移至醋酸纤维素膜，用含5%脱脂奶粉的PBS室温封闭1h;与兔抗脊髓灰质炎病毒多克隆抗体(1℃500稀释)孵育，洗膜，DAB显色。 　　1.8免疫原性检测 　　将Wister大鼠分为3组，10只/组，雌、雄各半，分别免疫sIPV、wIPV及199营养液(阴性对照组)，分别于第0、21天经大鼠大腿肌肉注射0.5ml。大鼠于免疫前经尾静脉采血，当日分离血清作为免前血