浅析葡萄糖酸钙对间斑寇蛛毒液致痛大鼠脊髓致痛因子表达的影响.docVIP

浅析葡萄糖酸钙对间斑寇蛛毒液致痛大鼠脊髓致痛因子表达的影响 　　新疆是世界范围内发生间斑寇蛛( 俗称“黑寡妇”) 咬伤人畜最多、程度最严重的地区之一。被间斑寇蛛咬伤患者均有剧烈腹部乃至全身疼痛，临床观察发现给患者静脉注射葡萄糖酸钙制剂能有效缓解疼痛。有研究表明，间斑寇蛛毒液可能参与激活 Ca2 +相关的离子通道，而这种离子通道的变化引起动作电位改变，激活感受器，将痛觉产生的传入冲动经脊髓背角整合传递到大脑高级中枢加工后，最终产生痛觉。因此，对致痛因子依赖于钙离子的钾离 子 通 道 蛋 白 ( IK1) 、降 钙 素 基 因 相 关 肽( CGRP) 、环氧合酶-2( COX-2) 、嘌呤能受体( P2X3)的研究至关重要。目前，间斑寇蛛毒液对致痛因子IK1、CGRP、COX-2、P2X3 表达量的影响及葡萄糖酸钙缓解疼痛的机制尚未见报道。本研究在间斑寇蛛毒致大鼠疼痛模型的建立及葡萄糖酸钙对其作用研究的基础上，从组织学、蛋白及分子水平观察间斑寇蛛毒液对大鼠脊髓中致痛因子 CGRP、COX-2、P2X3 和 IK1 表达量的影响，探讨葡萄糖酸钙缓解间斑寇蛛毒致痛作用的机制。 　　1 对象与方法 　　1. 1 间斑寇蛛粗毒液的准备及成分分析 采集间斑寇蛛后，利用活体取毒囊采毒法取毒。本课题组将所提取的新疆间斑寇蛛粗毒液送至湖南师范大学生命科学学院生物教研室，进行理化和生物学性质的分析。定量测定结果表明，粗毒的蛋白质含量为36.99%，对小鼠和蜚蠊的 LD50分别为0.39 mg/kg和2.32 mu;g/g。 　　1. 2 实验动物及分组 80 只雄性 SD 大鼠，均购自新疆医科大学实验动物中心。体质量 160 ～210 g，SPF 级，饲料经过 Co60照射，水经过灭菌处理，大鼠在安静环境中饲养 1 d 后，按体重分层随机抽样分为福尔马林致痛组、10、40、100、300 mu;L/kg 毒液致痛组( A1、B1、C1、D1和 E1组) 和 A2、B2、C2、D2治疗组，治疗组大鼠均采用尾部静脉注射的方式缓慢注射10%葡萄糖酸钙制剂 2 mL，注射结束后，治疗组与致痛组每只大鼠均于右足底皮下注射 5%福尔马林溶液 150 mu;L 和间斑寇蛛毒液 10、40、100、300 mu;L /kg，各剂量组各 8 只大鼠。 　　1. 3 免疫组织化学法 实验大鼠注射间斑寇蛛毒素24 h 后断颈处死，取脊髓 L4 ～5 标本，中性福尔马林固定，并进行脱水、包埋、切片等步骤，按照最佳稀释比例分别稀释兔抗 P2X3 多克隆抗体( 1∶500) 、兔抗 CGRP 单克隆抗体 ( 1 ∶ 50 ) 、小鼠抗COX2 单克隆抗体( 1∶ 200) 、小鼠抗 IK1 单克隆抗体( 1∶ 50) ( 美国 ABCAM 和美国 santa cruz 公司提供) ，上样量均为50 mu;L，按 SP 法免疫组化试剂盒操作步骤进行染色操作( 北京中衫金桥生物有限公司) ，脊髓后角神经元中棕色颗粒为染色阳性，400倍视野选择 P2X3、CGRP、COX2、IK1 阳性表达部位，每张切片找出3 个黏膜层阳性表达部位并采集照片。 　　1. 4 Western blot 法 L4 ～ 5 脊髓样本，研磨后13 000 r /min离心 15min，吸取上清液为组织蛋白溶液，置于液氮中保存。BCA 法测定蛋白浓度，然后按照 Western blotting 实验步骤处理组织蛋白溶液，一抗为兔抗 P2X3 多克隆抗体、兔抗 CGRP 单克隆抗体、小鼠抗 COX2 单克隆抗体、小鼠抗 IK1 单克隆抗体和小鼠抗 beta-actin 单克隆抗体( 前两者由美国ABCAM 公司提供，其余由美国 santa cruz 公司提供) ，二抗为兔抗小鼠 HPR 标记二抗和兔抗山羊HRP 标记二抗( 美国 Thermo scientific 公司提供) ，上样量预染蛋白 marker 5 mu;L，样品蛋白每孔加上样缓冲液补足 20 mu;L。显色后用 ChemiScope 3000 化学发光仪检测、拍照，使用软件分析处理，用 Image-proplus ( version 4. 1) 软件计算目的蛋白的灰度值，并与 beta-actin 比较，计算目的蛋白的表达丰度。 　　1. 5 荧光定量 PCR 技术 L4 ～ 5 脊髓样本，置于液氮中保存，研磨后用 Trizol 试剂( 美国 invitrgen 公司) 提取 RNA，采用 M-MuLV 逆转录试剂盒( 美国MBI 公司) 合成 cDNA。Real-time PCR 反应总体积为20 mu;L，含 cDNA 1 mu;L，引物 0. 8 mu;L( 10 mu;M)