简析人呼吸道合胞病毒截短 F1 重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性.docVIP

简析人呼吸道合胞病毒截短 F1 重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性 　　人呼吸道合胞病毒( Human respiratory syncytialvirus ，HRSV) ，属副粘病毒科，是引起婴幼儿病毒性肺炎最常见的病原，可引起间质性肺炎及毛细支气管炎。在中国多数地区，RSV 相关疾病流行高峰均在1 -2 月。2 岁以下婴幼儿、免疫缺陷及年老体弱者容易感染 RSV，流行时间与地理气候有关，温带地区每年11 月至次年 4 月流行，而热带雨林地区 RSV 呈全年流行。目前，尚无上市的人用 RSV疫苗。亚单位疫苗的研发主要集中于 RSV 的保护性抗原，即融合蛋白 F 和吸附蛋白 G[5]。RSV 只有一个血清型，A 和 B 二个亚型。在这两个亚型之间F 蛋白具有较高的氨基酸同源性，因此针对融合蛋白 F 抗原的中和抗体可以同时保护这两个亚型的 RSV 感染。此外，RSV 生命周期里最关键的一步是侵入宿主细胞，这一步由融合 F 蛋白来介导，所以该蛋白已经成为 RSV 疫苗的主要候选蛋白。融合 F 蛋白不仅具有抗体识别表位，还可以刺激机体产生 RSV 特异性 CD8+CTL 的靶抗原，CD8+T 细胞在宿主防御病毒感染中起到极为重要的作用，是清除病毒所必需的。F 蛋白可诱导体液免疫和细胞免疫，其主要的抗原表位集中于 F1 蛋白。与 F1 相比，实验中截短的 F1 蛋白缺失了 2 个抗原表位，这必然会或多或少地影响F1 蛋白的免疫原性。但是，F1 截短后其大部分抗原表位依然还在，这就保证了该蛋白的抗原反应性，在前期工作中通过 Western-blot 已得到了证实。实验中对前期构建并获得表达的截短F1 融合蛋白的包涵体进行了纯化及复性，旨在制备蛋白并进行动物免疫试验，最终对表达的蛋白进行免疫学评价。 　　1 材料与方法 　　1. 1 菌株 重组菌株 pET-42b-F1J / Rossata 由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室构建并保存，其中载体 pET-42b 和 Rossata 菌株均购自 Nova-gen 公司。 　　1. 2 主要试剂 低分子质量蛋白 Marker 购自TaKaRa 公司; 尿素、氧化性谷胱甘肽、硫酸卡那霉素和还原性谷胱甘肽均购自上海生物工程公司;NDSB-195 购自 Novagen 公司; L-精氨酸购自 AJINO-MOTO 公司 ; 聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂购自Bio-Rad 公司; 鼠抗人 RSV 单克隆抗体购自 Abcom公司; HRP 标记的兔抗鼠 IgG 购自 Sigma 公司; 镍离子亲和树脂购自 Invitrogen 公司; 阳离子交换层析介质 SP HP 购自 GE 公司。 　　1. 3 重组菌体的制备 吸取200 mu;L重组甘油菌pET-42b-F1J /Rossata 接种于含有卡 那 霉 素 的 100 mL LB 培养基中，37 ℃ 过夜振荡培养约 16 h。次日，按 1∶ 50 接种于 5 000 mL 含有卡那霉素的LB 培养基中，37 ℃ 摇床振荡培养至 A 值为 0. 6 时，加入 IPTG( 终浓度为1 mmol/L) 37 ℃诱导 5 h。收集5 000 mL培养液6 000 r/min 离心30 min，收集菌体。 　　1. 4 重组蛋白包涵体的洗涤及溶解 加入 5 mL /g湿菌体细胞裂解液[Tris HCI 50 mmol/L( pH 8.0) ，EDTA 1 mmol /L( pH 8. 0) ，NaCl 100 mmol /L]，悬浮菌体用高压破碎仪进行破碎，破碎液 12 000 r/min离心30 min，收集沉淀后分别用1%、1.5%和2%的Triton-X-100 先后进行 3 次洗涤，最终洗涤完毕的包涵体用溶解液( 8 mol/L 尿素，20 mmol/L 磷酸钠缓冲液，500 mmol/L NaCl，pH 7. 8) 进行溶解，12 000r /min 离心 20 min 收集上清。 　　1. 5 溶解蛋白的镍离子亲和层析纯化 按照 In-vitrogen 公司的 ProBondTM 纯化系统操作指南，对收集的包涵体溶解并将上清进行纯化，收集每步的洗脱样品进行 SDS分析。 　　1. 6 阳离子交换层析纯化 镍离子亲和层析纯化的样品进一步用 SP HP 阳离子交换层析柱进行纯化，以样品结合液 A( 50 mmol/L Tris-Cl，8 mol/L U-rea，pH 8. 0) 进行层析，洗脱时用 A + B( 50 mmol /LTris-Cl，8 mol /L Urea，1 mol /L NaCl，pH 8. 0) 进行线性洗脱，分别收集流穿峰和洗脱峰进行 SDS分析。