谈冠心舒通对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及脑组织Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响.docVIP

谈冠心舒通对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及脑组织Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响 　　脑血管病是临床常见病、多发病，其发病率、病死率逐年升高，在这一疾病相应的治疗过程中发现脑缺血再灌注( Cerebral ischemia-reperfusion，I /R) 的病理生理过程起着重要的作用。近年来研究发现脑I /R 损伤与细胞凋亡有着密切的关系，凋亡机制参与脑I /R 损伤已成为临床研究的热点。以往研究表明，冠心舒通具有调整、改善心血管功能的作用，它能减轻心肌缺血程度及减小梗塞面积、能降低血浆纤维蛋白原含量、抑制血小板黏附性和聚集性、改善血液流变性、增加冠脉血流量及改善心肌的供血供氧，对心肌缺血再灌注损伤有明确的保护作用，但对冠心舒通能否影响脑I /R 损伤的研究甚少，本实验通过检测大鼠学习记忆能力及细胞凋亡的调控，旨在探究冠心舒通是否对脑I /R 损伤具有保护作用。 　　1 材料与方法 　　1. 1 实验试剂冠心舒通胶囊( 咸阳步长制药有限公司生产，每粒装0. 3 g，国药准字产品批号100101) ; 兔抗鼠Bcl-2 和Bax 抗体购于北京博奥森生物有限公司; SP 和DAB 试剂盒购于福州迈新生物有限公司; ELISA 试剂盒购于南京建成生物有限公司。 　　1. 2 模型的制作采用线栓法，结扎大鼠左侧颈总动脉建立脑I /R 模型。选长约5 cm、直径0. 24 mm的美国进口尼龙实验栓线。用10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，麻醉满意后四肢及头部固定，颈部正中做2 cm 竖切口，先分离左侧颈总动脉，再分离左颈内动脉及颈外动脉，避免刺激迷走神经，沿颈内动脉向上走行分离翼腭动脉，结扎根部。假手术组仅暴露颈总动脉其他不作处理。造模成功标准清醒后评定: ( 1) 右侧前肢屈曲，不能完全伸展; ( 2) 提尾时，右侧前肢抓力减弱; ( 3) 提尾时向右侧转圈; ( 4)自由运动时，无方向性，向右侧转圈或倾倒; ( 5) 不能自发行走，意识丧失。造模成功后2 h 将栓线拔出形成再灌注模型。 　　1. 3 动物分组及给药健康的Wistar 大鼠60 只( 吉林大学白求恩医学部动物实验中心提供，动物许可证号: SCXK2007-吉大-0003) 。体重( 210 plusmn;20)g，每组15 只，随机分为假手术组、脑I /R 模型组、冠心舒通组; 冠心舒通组依据大鼠长期毒性试验分为:高剂量( 1 g /kg) 组和低剂量( 0. 5 g /kg) 组，冠心舒通将其研磨制成悬浊液。造模前每组分别每日灌胃给予生理盐水、生理盐水、冠心舒通高剂量和冠心舒通低剂量，连续7 d; 缺血120 min 后松扎，伤口撒头孢唑啉钠粉末0. 25 g 后逐层缝合，放回笼中饲养;假手术组仅分离颈总动脉，不做任何处理; 术后每天上午灌胃给予生理盐水、生理盐水、冠心舒通高剂量和冠心舒通低剂量，3 d 后水迷宫训练同时继续给药，连续7 d。 　　1. 4 动物检测选取实验结束后，去除死亡的和状态极差的大鼠，每组各取10 只检测。 　　1. 5 检测指标 　　1. 5. 1 Morris 水迷宫测试测试潜伏期、经过平台次数和平台象限停留时间，Morris 水迷宫训练7 d后，于第8 天测试。 　　1. 5. 2 大鼠血清中Bcl-2 和Bax 蛋白水平的检测采用ELISA 法检测，严格按试剂盒说明书操作。 　　1. 5. 3 大鼠脑组织的病理改变采用HE 染色观察，常规石蜡包埋，切片5 mu;m，光学显微镜下观察。 　　1. 5. 4 大鼠脑组织中Bcl-2 和Bax 蛋白水平的检测采用免疫组织化学-SP 法检测，切片3 mu;m，严格按试剂盒说明书进行。光学显微镜下观察结果: 细胞质阳性呈棕黄色，苏木精复染细胞核呈蓝色。 　　1. 5. 5 大鼠脑组织中Bcl-2 和Bax mRNA 水平的检测引物序列由上海生物工程公司合成。Bcl-2; 上游引物5#39;-CACATCTGGAGACTATAAGA-3#39;，下游引物5#39;- CTCTAAGTTGCGTTATCTAC-3#39;，产物242 bp;Bax: 上游引物5#39;-GCTAATGGAGGAGAAGAAGT -3#39;，下游引物5#39;-CTGACCTGTTGGACCTTGTG-3#39;，产物298 bp; 凝胶成像后用凝胶图像分析系统分析结果。 　　1. 6 统计学处理 　　采用SPSS13. 0 统计学分析软件，测试潜伏期、经过平台次数、平台象限停留时间、大鼠血清中Bcl-2 及Bax 的蛋白水平和脑组织中Bcl-2、Bax 的蛋白及mRNA 水平，其数据均以xplusmn;s 表示，进行t 检验。