谈牛樟芝对易卒中的自发性高血压大鼠脑蛋白质组学的影响.docVIP

谈牛樟芝对易卒中的自发性高血压大鼠脑蛋白质组学的影响 　　易卒中的自发性高血压大鼠(stroke-pronespontaneously　hypertensive　rats，SHRSPs)是从自发性高血压大鼠(spontaneously　hypertensive　rats，SHRs)中通过选择性交配，再经继代近亲繁殖培育而成。该品系的大鼠脑卒中的发生率在90%以上，因此SHRSPs被广泛用于高血压诱导脑卒中的发生发展机制研究。目前，已有很多传统药物被证实具有心血管保护作用，可在一定程度上减轻脑血管病变的严重程度。 　　牛樟芝(Antrodia　cinnamomea)又名牛樟菇，属于非褶菌目、多孔科、多年生蕈菌类，主要含有多糖体、三萜类化合物、腺苷等多种生理活性成分。已有研究证实牛樟芝具有免疫调节、抗肿瘤、抗血栓等多种生物学活性。牛樟芝体内含有的三萜类化合物能有效抑制血管紧张素的活性，发挥降血压作用。此外，有学者发现牛樟芝抗炎、抗血小板聚集、抗氧化活性与其体内含有的多糖类物质有关。因此，牛樟芝可能对易发脑卒中的高血压患者具有潜在的防治效应，而目前并无相关报道。本研究旨在明确长期服用牛樟芝对SHRSPs是否具有保护作用，能否延长SHRSPs的生存时间，并进一步运用蛋白质组学方法对其机制进行探讨。 　　1　材料和方法 　　1.1　药物、动物及试剂 　　药物牛樟芝于2012年8月购自宏潮生物健康科技推广中心，并经解放军302医院药学部临床药理研究室黄正明教授鉴定。SHRSPs购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(沪)2009-0015。Wistar　Kyoto(WKY)大鼠(雄性，180～220g)购自军事医学科学院动物中心，动物许可证号：SCXK-(军)-2007-004。固相pH 梯度干胶条(IPG　strip　pH　3～10，17cm，Bio-Rad公司)，尿素(Sigma公司)，硫脲(Sigma公司)，3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS，Amresco公司)，两性电解质(Bio-Lyte，Bio-Rad公司)，矿物油(Bio-Rad公司)，二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT;Merk公司)，Tris-HCl(上海增健生物科技有限公司)，十二烷基苯磺酸钠(sodium　dodecyl　sulfonate，SDS;Bio-Rad公司)，碘乙酰胺(Bio-Rad公司)，过硫酸铵(ammonium　persulfate，AP;Bio-Rad公司)，40%丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺配胶液为291(上海增健生物科技有限公司)，四甲基二乙胺(N，N，Nprime;，Nprime;-tetramethylethylenediamine，TEMED;Sigma公司)。谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione　S-transferase，GST)抗体和超氧化物歧化酶(superoxide　dismutase，SOD)抗体均购自Santa　Cruz公司。总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒、GST活性检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。 　　1.2　仪器设备 　　Eppendorf冷冻离心机、等电聚焦电泳仪、垂直电泳仪、凝胶成像扫描仪购自Bio-Rad公司，Odyssey 红外激光成像系统购自LI-COR公司。 　　1.3　动物分组 　　80只SHRSPs(5月龄，雄性)随机分为对照组和牛樟芝给药组，每组40只。牛樟芝给药组采用灌胃治疗，剂量为150mg/kg，连续给药，每天1次，观察并记录大鼠的死亡时间。 　　另外再取6只SHRSPs(5月龄，雄性)随机分为对照组和牛樟芝给药组，每组3只。牛樟芝给药组采用灌胃治疗，剂量为150mg/kg，连续给药，每天1次，连续90d。用3只WKY 大鼠作为正常对照。实验结束后取脑组织进行二维电泳。 　　1.4　蛋白质抽提及蛋白浓度测定 　　处死大鼠，取全脑，置于冰冷的PBS中洗净血液，然后放入预冷的匀浆管中加入5mL蛋白提取液(裂解液)，冰上匀浆至无肉眼可见的组织块。冰上孵育40 min。4℃10　000times;g 离心20min，取上清。运用2-D　Quant试剂盒进行浓度测定。具体步骤见参考文献。 　　1.5　电泳 　　第一向等电聚焦电泳(IEF)程序：30V6h，60V6h，100V1h，200V1h，500V1h，1　000V　1h，1　000～8　000V30min，8　000V7.5h。　　在等电聚焦电泳结束时，将胶条在平衡液Ⅰ和Ⅱ中分别平衡14min，再进行垂直电泳。第二向电泳程序：80V30min