遗传实验参考 果蝇大实验 转基因果蝇的杂交重组和鉴定.docVIP

果 蝇 大 实 验 转基因果蝇的杂交重组和鉴定 实验日期：4/5～5/24 实验地点：生物旧馆遗传学实验室 实验者：2010080086 郑世喜 同组实验者：胡璞，兰陆红，谢雨辰，潘新蕾 实验目的： 插入在同一个染色体上的不同目的基因（分别处于两个品系果蝇中）通过重组交换整合到同一品系果蝇的同一染色体上，并得到可以稳定保存的品系（balanced或homozygous）。 背景知识： 转基因果蝇（transgenic fly）是将带有目的基因的质粒通过显微注射转入白眼果蝇卵中，这些质粒上一般带有P转座子序列（P elements are transposable pieces of DNA that randomly insert themselves into genomic DNA），使得目的基因可以插入到果蝇染色体中。一般使用白眼果蝇的卵进行显微注射，质粒上带有的mini-white基因（红眼）可以作为转基因成功的标记（marker），带有目的基因的果蝇将成为红眼果蝇。mini-white的表达量决定了果蝇眼睛红色的深浅，这与目的基因插入位置和copy数目有关（可请学生思考为什么——插入位置附近的染色体结构和启动子决定mini-white表达量，纯和果蝇比杂合果蝇表达量也高，有多个插入位点的比单个插入位点的表达量高，一般情况下只有一个插入位点）。常用的带P转座子载体示意图如下： 实验提供的转基因果蝇，由于受质粒大小的限制，一般一个转基因果蝇品系只能转入一个目的基因，有时需要把不同目的基因整合到同一个果蝇品系中，研究两个基因的功能及相互作用等。如果两个目的基因都插在不同果蝇品系的同一个染色体上，可以通过遗传重组的方法得到重组型后代（眼睛颜色），重组型后代将在同一个染色体上同时带有两个目的基因，并可以建立稳定保持的品系。例如有基因A的转基因果蝇系tA和基因B的转基因果蝇系tB，A和B分别插在tA和tB的三号染色体上（t表示transgenic），通过重组交换可以得到三号染色体上同时带有基因A和基因B的转基因果蝇系tAB，将tAB稳定保存即可。 重组实验还需要带TM3平衡子(balancer)的果蝇来辅助，带平衡子的果蝇相应染色体不能发生重组，使得杂交过程和鉴定方法更为简单。 另外，还需要应用到一个UAS-Gal4系统的神经细胞的driver，为GMR-Gal4，进行重组成功的鉴定。 GAL4/UAS系统是目前果蝇中十分常用的实验系统（见下图说明）。该系统利用组织特异性的启动子或增强子，将GAL4基因与启动子或增强子相连接,建立GAL4转基因系，通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式来控制GAL4的表达。另外，将UAS与靶基因融合，建立带有UAS-靶基因的转基因系。在杂交后代中,特异性表达的GAL4能以同样的方式调节UAS-靶基因的表达。 Figure 1 果蝇中GAL4/UAS系(Daniel St Johnston, 2002) 实验材料： 转基因果蝇A、B/Ser(翅膀缺刻)、 +/Sb balancer（白眼，平衡子Sb，短刚毛）的果蝇以及GMR-Gal4果蝇。 其中，tA果蝇系为纯合体，转入Tau基因，该转基因与GMR-Gal4果蝇系进行杂交，其在GMR-Gal4的驱动下，产生子代的成体果蝇眼睛缺陷，表现为发育不全。tB果蝇系为纯合致死，带有一个Serrate（翅膀缺刻）的balancer，其自身带有GFP基因，能自发绿色荧光，在荧光显微镜下可观察。 本实验中可能用到的balancer为： 染色体 Balancer 显性表型标记 （dominant phenotypic marker） 纯合 （homozygous） 3 TM3 Sb（短刚毛） 致死（lethal） 3 TM3 Serrate（翅膀缺刻） 致死（lethal） 实验设计： 实验步骤： A/A和B/Ser杂交。（我们组分别做了A/A(♂)xB/Ser(♀)和 A/A(♀)xB/Ser(♂)） 他们的后代当中挑出A/B(♀)。后代有A/B和A/Ser，A/Ser是残刻翅果蝇，雌雄通过观察几个明显的特征来筛选挑出A/B(♀)。 A/B(♀)和+/Sb进行杂交。后代有8中可能，当中 /+不会涌出来，挑出短刚毛果蝇，即，包含Sb的果蝇。（不包含 /Sb） 挑出的果蝇可能的基因是：A/Sb、B/Sb、AB/Sb。（其他果蝇都是白眼的）挑出8只雄蝇，分开放培养瓶里，跟GMR-Gal4进行杂交。检验他们的子代既有A的特性又有B的特性的。（既有眼睛缺陷又有绿色荧光） 找回他们的父亲，即AB/Sb，跟+/Sb进行杂交。 Figure 2 成蝇短刚毛参考图片 Figure 3 果蝇突变体参考图片1 Figure 4 果蝇突变体参考图片2 实验