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植物原生质体的制备及融合 生64 范泓洋 2006030003 2008.3.27 一、 实验目的： a) 学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。 b) 学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。 二、 实验原理 i. PEG 融合： 利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认 为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、 进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的 重排质膜在修复时相互合并在一起, 使两细胞的胞质沟通, 从而造成相互接触的细胞之间发 生融合。现在的流行的假设有两种：一种时说PEG分子吸附在膜的表面，通过长分子的牵拉 和吸附作用使原生质表面间形成分子桥面聚集；还有一种假设是说PEG分子在膜表面的耗减， 或者说脱离，产生的范德华力使细胞聚集以致融合。近来的一些实验通过对水溶液和PEG溶 液中膜表面的粘滞性的精确测量指出在PEG中细胞表面的粘滞性更接近水溶液中的，而并非 大量PEG中，由此间接支持了第二种假设。但是个人认为，这个假设是否成立还有待于更直 接的实验证据。 - 5 - 3 PEG法将病毒法诱导产生杂交细胞的频率由10 提高到10 。PEG诱导细胞融合的效果, 同其相对分子质量大小及浓度高低、作用时间、PH值密切相关。PEG相对分子质量、浓度增 大,促进细胞融合的能力提高了,但它对细胞的毒性也随之增大,故通常选相对分子质量在1000 - 6000 ,浓度在30 %- 50 %的PEG,并且严格控制PEG的作用时间,减少它对细胞的毒性,PH 值一般选在7.4 --8.0 之间。现在采用PEG时,一般是同时采用高pH值，高Ga2+浓度的溶液来 促进细胞膜融合,或加入二甲基亚砜(DMSO) 来提高PEG诱导细胞融合。 特别是在低相对分 子质量和较低浓度的PEG中,DMSO的效果更加突出。 三、 实验用品： 仪器：显微镜、低速台式离心机、水浴锅；直式漏斗、离心管；眼科镊、300 目尼龙网、10ml 离心管、载玻片、小平皿 试剂： 洗涤液、酶混合液、PEG 溶液、高Ca，高pH 洗涤液、蔗糖溶液（20%） 实验材料：剑兰花瓣 四、 实验步骤： a) 原生体的制备 i. 将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。 ii. 用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。 iii. 酶解好的原生质体混合液经300 目尼龙网过滤到10ml 离心管，加入少量洗涤液定容至 4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。 iv. 500rpm 离心5 分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml 吹打均匀。500rpm5min 重复 离心一次，彻底去除酶液。 v. 加5 滴洗涤液，悬浮原生质体。 vi. 镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。 b) PEG 融合： i. 在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静臵沉淀。 ii. 各缓缓滴加一滴PEG 在其中两滴原生质体悬液上， iii. 在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH 洗液。 iv. 镜下观察，1-2 分钟后，在原先加入PEG 的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH 洗液。 v. 镜检，记录结果。 五、 实验结果：（见附图） 六、 实验讨论： a) 关于其他融合技术的讨论： 物理融合技术：现在常用的物理融合技术有电融合与激光融合技术。 i. 电融合：Zimmermann 在1978 年首先采用电脉冲方法成功地诱导了细