第二讲基因组序列诠释.ppt

* 随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNA序列称为ＥＳＴ。 EST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的３’端和５’端部分cDNA随机片段，每个EST长度约200～600bp,代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列。由于大多数ＥＳＴ的长度不足400bp,说明一个基因转录本的cDNA序列可能包含多个序列重叠的EST，由于一个基因mRNA剪接点不同可以获得多个cDNA克隆，因此EST既可能对应于一个cDNA的某一部分，又可能代表mRNA的不同剪接方式?。 任何单一DNA顺序都可作为STS，特别是已在连锁分析中（遗传图中）定位的SSLP，其可建立物理图与遗传图之间的联系。 * 网上克隆 * X射线 C 质谱技术的其他作用 质谱可对蛋白质二硫键进行定量和定位，分析蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质与其他分子的相互作用，以及蛋白质的二级结构等。 6.4蛋白质组数据库的建立和生物信息学 数据库的建立是蛋白质组研究的最重要的一个方面。 蛋白质的数据库包括： 蛋白质序列数据库 质谱数据库 双向电泳图谱数据库 有关蛋白质结构的数据库 6.5 与疾病相关蛋白质研究的基本策略 6.6 蛋白质组研究的目的 建立蛋白质互作网络 为人们了解生物体的各个生长、发育期的各个蛋白质有机组成、协作，更完整的解释各种生命现象奠定基础 促进人类疾病的治疗 本章要点 已知一个DNA片段，如何预测其开放读码框? RACE技术的基本原理是什么? 动物园杂交的原理 基因剔除法 RNAi的作用原理及应用 酵母双列杂交的原理 SAGE 的基本原理及技术路线 什么是蛋白质组、蛋白质组学，以及蛋白质组的研究目的和意义？ 第三章 物理作图(physical mapping) 物理作图: 应用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置 物理图的距离: 依作图方法而异,辐射杂种作图的计算单位为厘镭(cR);限制性片段作图与克隆作图的图距单位为碱基对(bp) 物理作图的方法 限制酶作图(Restriction Mapping) 依靠克隆的基因组作图(clone-based mapping) 荧光原位杂交(Fish, Fluorescent in situ hybridization) 序标位作图 (STS，Sequence taged site) 1. 限制性作图 它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置. 其只能应用于较小的DNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率. 通常采用的6碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb以下DNA分子的精确作图. 1.1 限制酶作图(Restriction Mapping)基本原理 1Kb EcoR I 待检的DNA BamHI 15Kb 6Kb 5Kb 10Kb 9Kb E B B H H E H H H H E+B E B 6Kb E H 4Kb E B 5Kb B H 跨叠克隆群(Contig) 酶切位点 1.2 限制酶作图的改进 脉冲凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis) 稀有切点限制图绘制 稀有切点限制图绘制注意事项: 识别顺序越长产生的片段越大; 识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小; 如人类基因组A/T比例接近60/%,选用高比例A/T位点限制酶,产生的片段多于高比例G/C识别位点酶 有些限制酶识别位点较长 如酵母的Ⅰ-Sce识别顺序为18bp, 如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌体转导的方法将其引入代测基因组中. 基因组DNA 的甲基化状态 如人类活细胞基因组中大量5’-CG-3’顺序的胞嘧啶被甲基化,使许多含有5’-CG-3’顺序的内切酶很少找到可切位点. 2.1 大片段DNA的克隆载体 YAC: 酵母人工染色体 230-1700Kb BAC: 细菌人工染色体 300Kb PAC: P1人工染色体 300Kb Fosmids: 30Kb 2. 基于克隆的基因组作图 2.2 重叠群组建 重叠群:相互重叠的DNA片段组成的物理图. 重叠群的组建方法 染色体步移法 指纹作图法 指纹:系指确定DNA样品所具有的DNA片段; 一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征. 常用的指纹分析方法: A 限制性带型(restriction patt