第21章常用分子生物学技术的原理及其应用1.pptVIP

常用分子生物学技术的原理及应用 The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology 第21章 第一节 分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理 （一）印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 （二）探针技术 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹 (Southern Blotting) （二）RNA印迹 (Northern Blotting) （三）蛋白质的印迹 (Western Blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 用于RNA的定性定量分析。 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 其他： 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip) 三种印迹技术的比较 分子杂交实验 ① ② ③ 放射自显影照片 DNA点阵 第二节 聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction 5? Primer 1 5? Primer 2 5? 5? Template DNA 一、PCR技术的工作原理 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR体系基本组成成分 PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段； 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。 二、PCR技术的主要用途 （一）目的基因的克隆 利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 （三）DNA和RNA的微量分析 （二）基因突变 将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度； 待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。 PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 （一）逆转录PCR技术 三、几种重要的PCR衍生技术 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 实时PCR技术原理 第三节 核酸序列分析 Nucleic Acid Sequence Analysis 核酸序列分析的基本原理： 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (Sanger法) 一、DNA链末端合成终止法 链末端合成终止法测定DNA序列的原理 二、DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种