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植物功能基因组研究技术进展 学生　李大红 导师　梁建生教授 引言 基因的功能 生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰； 细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径； 发育上功能，如参与形态建成等。 研究方法 突变体， 反义RNA， RNAi， 基因表达的系统分析， DNA芯片等。 突变体是研究基因功能的传统方法 获得突变体的方法 物理因素；指某些射线，如Y射线、X射线、B射线和中子流等； 化学诱变剂: 指某些烷化剂，碱基类似物，抗生素等化学药物。 由重组DNA技术衍生出的插入突变: 它是人为地造成某一待研究基因的突变体，并根据由此带来的表型特征的改变来分析该基因的功能，然后再进行基因等分子水平上的研究， 水稻突变体 水稻突变体 水稻突变体库研究进展 突变体的缺陷 这主要表现在突变必须被测序或者做图以证明他们的位置，并且突变材料的大规模收集必须要通过对整个基因组进行筛选。这些限制也就意味着基因组规模上的突变：技术含量底，工作量过大。而且突变具有很大的随机性，经常给实验带来不便， 反义RNA 反义RNA在基因功能鉴定的应用 A、在研究植物胚的发育，使用了反义RNA技术。 Bicoid 是调控果蝇胚胎极性及以后分节发生过程的重要基因。从水稻cDNA 文库中分离了一个同果蝇Bicoid 有相当同源性的克隆- Rb24 基因。 为进一步了解它在水稻中的功能,将Rb 的反义基因片段通过农杆菌的介导转入水稻中。 结果表明细胞和组织的分化在胚的发育过程中被阻断了。 因此Rb 基因同控制水稻胚的发育有关。。 B、光合作用的Lhca4 基因功能的研究 Lhca1 和Lhca4 编码LHC Ⅰ蛋白,该蛋白是光合系统ⅠPS Ⅰ的叶绿素a　Pb 结合蛋白。通过反义技术,　Zhang等 研究Lhca4 的功能。 实验表明,在转基因株系中,Lhca4 蛋白的减少并未引起Lhca1 蛋白的降低,由于Lhca4 蛋白的减少,低温荧光发射光谱明显地改变了,而且发射最大值向蓝光偏移了6nm ,说明与Lhca4 相关的叶绿素分子与长波长荧光发射光谱有关。 C、番茄的pTOM5基因功能鉴定　 利用反义RNA 技术对基因表达部分抑制可以产生转基因株系。pTOM5 基因是番茄果实成熟过程中类胡萝卜素的合成基因。pTOM5 反义基因转入番茄中,果实呈黄色,花呈淡黄色,类胡萝卜素合成受阻,含量减少了97%。由此推测pTOM5 是控制果实成熟及类胡萝卜素合成的一个基因 。 RNAi RNAi技术在鉴定植物基因功能中的应用 RNAi 技术应用于植物功能基因组研究最初是在土豆中通过PTGS 诱导产生抗RNA 病毒抗性能力及在水稻中使报告基因GUS 沉默的能力来比较正义链、反义链及dsRNA 诱导RNAi 效率的高低。 接着Chuang 等在花发育研究中采用RNAi 技术进一步验证AG、CLV3、AP1、PAN 等已知功能基因,并开创了RNAi 在植物功能基因组学中的应用(Chuang CF , et al, 2000)。 Gong 等（2002)克隆了拟南芥SOS家族样的蛋白激酶基因PKSes的一个成员PKS18,构建了PKS18的RNAi载体,研究其转基因植株,发现由于PKS18 表达在转录水平上受抑制,并表现对ABA 不敏感,证实PKS18 与ABA 信号转导有关。 由于拟南芥是目前植物基因组资源研究最深入的植物种类,所以RNAi 技术在植物功能基因组中的研究主要体现在拟南芥功能基因组的研究上,　CATMA　(Complete Arabidopsis transcrip2tiome microarray) 计划以及AGRIKOLA　(Arabidopsis genomic RNAi knock - out line analysis) 都在应用RNAi 进行大规模的拟南芥功能基因组的分析。 除此之外,RNAi 技术在其它植物功能基因分析中也得到尝试.例如Kenichi 等(2004) 应用RNAi 技术分析并证实phEIN2 基因在牵牛花中乙烯信号传导中具有重要作用, Senthil 等(2005) 用RNAi 技术分析了异黄酮合成酶基因在大豆子叶及根部的作用效果及其对异黄铜积累的影响,证实大豆子叶对基于RNAi的基因功能分析有效。 基因表达的系统分析(原理) 从转录本的3′端特定位置分离出的该转录本特异的标签( tag) 包含有足够的能代表该转录本所需之信息, 依SAGE 方法之不同, 这一标签的长度通常在9～14个核苷酸之间变化。 将多个短序列标签串连在一个克隆中，通过测序以连续的方式同时分析多个标签及其代表的转录子，明显提高了分析效率。 根据测序结果，计算某一标签出现的次数来确定相应转录子的拷贝数与表达水平。 基因表达的系