大鼠C-sis基因克隆及其真核表达载体的构建.doc

大鼠C-sis基因克隆及其真核表达载体的构建 孙国芳1，丁 浩2(南昌大学第二附属医院，1心电诊断室，2消化内科，江西省南昌市 330006) 引用本文：孙国芳，丁浩. 大鼠C-sis基因克隆及其真核表达载体的构建[J].中国组织工程研究，2016，20(49):7418-7424. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.018 ORCID: 0000-0001-8793-9069(孙国芳) 文章快速阅读： 文题释义： 基因克隆：是20世纪70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为分、切、连、转、选。“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入宿主细胞，在宿主细胞内目的基因被大量的复制。 C-sis：是血小板衍生生长因子B链的编码基因。C-sis的基本功能是通过多种机制促使有丝分裂信号向胞内转导并促进细胞增殖。C-sis编码的蛋白血小板衍生生长因子B是一种较强的促有丝分裂源和化学诱导剂，可刺激间胚叶来源细胞的分裂、增殖，对血管的再生及创伤愈合有良好的促进作用。故C-sis具有促进细胞增殖并抑制凋亡，进而促进组织修复的功能。 摘要 背景：原癌基因C-sis具有促进细胞增殖并抑制凋亡，进而促进组织修复的功能。假设C-sis可能在受损肝组织的修复和暴发性肝衰竭的治疗中发挥积极作用。 目的：构建pcDNA3.1/C-sis真核表达载体，检测其在大鼠正常肝细胞株BRL细胞和在体大鼠肝脏细胞中的表达。 方法：通过RT-PCR的方法克隆C-sis基因的选全长编码序列，构建pcDNA3.1/C-sis真核表达载体。鉴定无误后经脂质体介导转染到BRL细胞中，并通过将质粒注入尾静脉后导入大鼠肝脏。最后通过荧光定量PCR和Western Blot鉴定其在BRL细胞和在体大鼠肝脏细胞中的表达。 结果与结论：①成功克隆了C-sis基因全长编码区；测序证明pcDNA3.1/C-sis重组真核表达载体构建成功；②将其转染至BRL细胞和在体大鼠肝脏，可使C-sis表达升高；③实验结果为后续研究C-sis基因对大鼠暴发性肝衰竭的影响提供了先决条件。 关键词： 实验动物；基因病毒载体相关因子模型；基因克隆；C-sis；大鼠；转染；真核表达载体；酶切；脂质体；鼠尾静脉；国家自然科学基金 主题词： 动物，模型；基因；脂质体；转染；组织工程 基金资助： 国家自然科学基金资助项目；江西省青年科学基金资助项目(20151BAB215006)；江西省青年科学基金资助项目(20132BAB215015) Cloning of rat C-sis gene and construction of its eukaryotic expression vector Sun Guo-fang1, Ding Hao2 (1Diagnosis Room of ECG, 2Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China) Abstract BACKGROUND: C-sis proto-oncogene can promote tissue repair by inducing cell proliferation and inhibiting cell apoptosis. Therefore, C-sis may play a positive role in the repair of damaged liver tissue and the treatment of fulminant hepatic failure. OBJECTIVE: To construct pcDNA3.1/C-sis eukaryotic expression vector and detect its expression in BRL cells (the normal liver cells of rats) and rat liver cells in vivo. METHODS: The full-length coding sequence of C-sis gene wa