第四章分子生物学方法选读.ppt

* * 2-DE包括等电聚焦（isoelectric focusing, IEF）及SDS两种电泳技术。该方法根据蛋白质的两个性质即等电点和分子量。 以两性电解质为介质的电泳体系，不同等电点蛋白会聚集在介质的不同区域（等电点）； SDS将不同分子量的蛋白质分离。 * * 凝胶的图像处理和分析 典型流程 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递和解释： 2-DE数据库的建立： * * 二、蛋白质免疫印迹实验 原理： 确保蛋白质解离为单个多肽亚基能与SDS结合； 通过分离胶的筛分作用，将蛋白质多肽按分子量的大小不同得到分离； 将蛋白质固定于膜上； 以抗体识别待检蛋白（抗原）。 固 定 物 2Ab E 蛋白质 （抗原） 1Ab * * 典型的印迹实验包括五个步骤： ① 蛋白样品的制备； ② 经过SDS分离样品； ③ 将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域； ④ 用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与固定的非标记抗体结合； ⑤ 洗去未结合的一抗，加入标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白质成分。 * * * * 用于检测的二级抗体一般分为三种： 放射性标记的抗体 与酶相偶联的抗体 与生物素相偶联的抗体 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酯酶 * The intercalation dye begins adding at the Extension step. When the proper wavelength is applied, the fluorescence of bound dyes is very high over background. Sybr Green = 495 nm * Again, same as the basic PCR reaction. However, a TaqMan probe is added. Note that the reaction is quiet when intact. * The Extension and detection step is a 4 step process. 1) Strand Displacement - The probe and Taq Polymerase comes in contact. 2) Cleavage - The probe is cleaved through the 5’ to 3’ exonuclease activity of Taq DNA polymerase. 3) Polymerization Complete - Probe is entirely cleaved. Extension is complete. 4) Detection - Apply proper wavelength and detect signal. * Plot of Ct versus copy number. Note the Dynamic Range of 101 to 1010. * * * * 分离mRNA的试剂盒 可应用Promega PolyAT tract mRNA分离系统分离poly(A)mRNA。将用生物素标识的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。 * * 三、 cDNA 的合成 可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA； 应选用活性较高的反转录酶（Reverse transcriptase）； 应选用甲基化dCTP(防止被限制性内切酶切割)； 应保证所获得双链cDNA的方向性(cDNA两端加上不同内切酶所识别的接头序列); 因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5’-methyl C的外源DNA，所以，应选用mcrA- ,mcrB-菌株。 * * * * 定向cDNA的合成及分子修饰 * * 四、cDNA文库 将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合成cDNA，与载体连接，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为cDNA 文库。cDNA文库具有组织细胞特异性。 构建cDNA文库，材料来自mRNA cDNA文库只含有mRNA的分子结构, 不含真核基因的间隔序列和调控区。 * * cDNA文库的特点： ①出发材料是一定时空条件下的细胞总mRNA, 在转录水平上反映生物在特定发育时期、特定组织(或器官)在一定环境条件下的基因表达情况。 ②不同组织